论文部分内容阅读
流行病学研究数据表明,心血管疾病是当前世界上致人死亡的首要原因。动脉粥样硬化是一种慢性血管性病变,特点为粥样斑块形成与血管内膜,并逐渐扩展引起管腔狭窄或阻塞。这种血管紊乱状态被认为是许多心血管疾病的病理基础,如冠状动脉疾病和缺血性卒中。近些年基础研究发现,动脉粥样硬化发生与进展取决于体内多种病理生理学事件,如血脂代谢异常、血管内皮损伤、炎症反应、血栓形成和免疫失调等。麝香保心丸（SBP）,作为一种传统中药复方制剂,已广泛在亚洲国家运用于治疗部分心血管疾病。然而,SBP是否对动脉粥样硬化有治疗作用目前尚缺乏研究。在本研究中,我们观察了SBP对动脉粥样病变产生的影响,并探索了其中的分子作用机制。第一部分SBP对高脂喂养apoE-/-小鼠动脉粥样斑块负荷的影响及其发挥的血脂调节功能目的:明确SBP灌胃处理对apoE-/-小鼠主动脉粥样斑块大小是否产生影响;研究SBP对小鼠血脂谱以及肝脏血脂代谢相关分子表达的影响。方法:取8周龄雄性C57BL/6遗传背景的apoE基因敲除小鼠,适应性喂养2周。随之将apoE-/-小鼠随机分为2组,且均给予高脂饲料（21%脂肪+0.15%胆固醇）喂养。同时一组小鼠进行SBP（25mg/kg）灌胃处理,另一组小鼠给予同等体积的生理盐水灌胃。20周后结束处理,给予戊巴比妥钠麻醉小鼠,采集血液。小鼠安乐死后,迅速分离心脏、主动脉及肝脏,保存用于后续实验。小鼠主动脉采用油红O染色检测斑块分布及大小;制作主动脉窦部位石蜡切片和冰冻切片,采用HE染色、Masson染色及免疫组化等方法观察斑块特点;收集的小鼠血液进行血浆分离,随之检测血浆中甘油三酯（TG）,总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）;使用western blot检测肝脏中血脂调节相关蛋白LDLR,HMRCR,p-HMGCR,SREBP1c,ACC,FAS,PPARα,CPT-1A,AMPK,p-AMPK表达水平。结果:主动脉大体油红O染色显示高脂喂养20周诱导的动脉粥样硬化模型成功,且SBP灌胃显著降低了动脉粥样斑块的分布面积。血生化结果表明,SBP处理组的血脂谱较生理盐水对照组明显改变,其中TG、TC和LDL-C降低,HDL-C水平升高。此外,肝脏蛋白免疫印迹结果显示,SBP处理引起LDLR、PPARα、CPT-1A,p-HMGCR和p-AMPK水平提高,同时使SREBP1c,ACC,FAS表达下调。结论:SBP灌胃给药对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化发展产生有效的抑制作用,并对血脂谱有明显的调节效应,其调脂机制在于影响肝脏中血脂代谢相关蛋白的表达。第二部分SBP对高脂喂养apoE-/-小鼠体内炎症反应的影响及其对血管内皮损伤的干预作用目的:分析SBP灌胃给药对apoE-/-小鼠体内系统炎症及血管壁炎症反应所产生的影响;明确SBP对高脂喂养过程中小鼠血管内皮损伤是否有干预效果。方法:采用SBP灌胃处理20周后,收集小鼠血浆、心脏及主动脉。制作主动脉窦部位横截面切片,免疫组化染色检测内皮损伤标志物;采用ELISA试剂盒检测血浆中TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-10和TGF-β1浓度;使用血生化法检测循环中MDA、MPO、H2O2、SOD、GSH和NO含量;western bolt检测主动脉组织中炎症相关蛋白和凋亡信号分子的表达水平。结果:与生理盐水对照组相比,SBP处理组血浆中TNF-α、CRP、IL-1β、IL-6和MCP-1含量下降,IL-10和TGF-β1浓度上升。此外,SBP组血中反映氧化应激程度的标志物MDA、MPO、H2O2含量减少,而抗氧化指标SOD和GSH水平升高。免疫组化结果显示,cleaved caspase-3在SBP灌胃组的血管壁中表达水平显著下降,且血中NO含量增高。SBP处理后,小鼠血管壁中炎症蛋白VCAM-1、ICAM-1、IL-6和IL-2表达减弱,且炎症相关信号通路分子如p38、JNK和NF-κB活性降低,Mfn2升高。此外,主动脉壁的线粒体途径凋亡信号分子Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP在SBP处理组的水平明显低于对照组。结论:SBP处理能明显的抑制apoE-/-小鼠体内系统、血管壁炎症以及内皮凋亡、进而缓解动脉粥样硬化的进展。