豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)又名东星斑,为富含虾青素名贵海产品,营养价值高;但随着养殖密度提升,病害和用药问题凸显,因此,急需科学有效的绿色健康安全养殖技术。乳酸菌为食品安全级微生物,通常认为可改善肠道菌群,提高宿主消化能力。本研究应用唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius GZPH2)于豹纹鳃棘鲈养殖生产中,设置两组不同浓度实验组:B组(1.3×10~7CFU/g)、C组(7.3×10~6CFU/g),与对照A组(0 CFU/g)一起,采用间隔性拌料饲喂方式,为期8天(1 d为背景值,2-4 d应用GZPH2,5-8 d停用),每天采样,开展微生物组学和代谢组学研究。(1)首先,采用传统细菌学手段,研究了GZPH2对豹纹鳃棘鲈体表和肠道中可培养总细菌数(TCBC)和可培养总弧菌数(TCVC)影响。结果表明,与对照组相比,GZPH2显著降低了实验组中体表和肠道中TCBC与TCVC浓度(p<0.05),且低浓度GZPH2对TCBC和TCVC控制作用更好。Pearson相关性分析表明,GZPH2浓度仅与体表TCBC显著负相关(p<0.05),与肠道TCBC、体表和肠道TCVC相关性不显著(p>0.05)。此外,与对照组相比,两组GZPH2均显著提高了豹纹鳃棘鲈体长与体重获得率(p<0.05)。(2)其次,采用基因组学的16S rDNA基因V3-V4区高通量测序技术,对1 d、4 d、8 d样品开展豹纹鳃棘鲈肠道菌群微生物组学研究。结果表明:9个样品共得到466977条有效序列。经过OTU聚类分析,得到豹纹鳃棘鲈肠道中的固有菌群,分别为厚壁菌门(Firmicutes),变形菌门(Proteobacteria),放线菌门(Actinobacteria),Patescibacteria超门,拟杆菌门(Bacteroidetes)等。拟杆菌门与厚壁菌门比值可指示鱼生长的快慢:比值越低,生长速度越快;反之则反。饲养前期(1-4 d),B、C两组比值分别降为0.250和0.003;饲养后期(5-8 d),B组该值进一步降为0.001,C组则略升为0.004。A组该值在整个试验期间均较高(4 d:0.503,8 d:0.454)。该结果在前面所述的体长和体重获得率上得到了印证。PCoA分析发现,A组样品与B、C组明显分离,表明肠道菌群组成存在较大差异。物种组成变化分析发现,4 d时,A组芽孢杆菌纲(Bacilli)、放线菌纲(Actinobacteria)、丙型变形菌纲(Gammaproteobacteria)相对丰度分别为6.58%、13.54%、29.56%,B组为4.84%、14.18%、49.26%,C组为91.57%、0.52%、6.06%;8 d时,该三纲在A组中相对丰度分别为4.91%、12.55%、47.54%,B组中分别为20.21%、0.36%、6.50%,C组中分别为44.70%、1.21%、23.87%。芽孢杆菌纲和放线菌纲之菌利于豹纹鳃棘鲈对病害的抵御能力,而丙型变形菌纲则具迟滞鱼生长、乃至引发病害的可能。因此,该结果表明了B组(高浓度)乳酸菌在控制潜在有害菌丙型变形纲的有效作用。在相对丰度占前20的菌属中,1-4 d,高浓度GZPH2能控制其中30%(6/20),其中革兰氏阴性(G-)菌4个,革兰氏阳性(G+)菌2个,低浓度GZPH2能控制其中35%(7/20),G-菌4个,G+菌3个;4-8 d,高浓度GZPH2能控制其中50%(10/20),G-菌与G+菌各半,低浓度GZPH2能控制其中25%(5/20),G-菌2个,与G+菌3个。此外,研究还发现8 d时高浓度GZPH2在提高益生菌/功能性菌群总相对丰度(+76.89%)的同时降低了(条件)致病菌的总相对丰度(-11.77%),低浓度GZPH2则无此效果。肠道菌群组成上的差异必然带来功能上的变化。4 d和8 d时A、B、C三组功能丰度差异极显著(p<0.01)。A组组内变化不大(p>0.05),B、C组绝大多数功能丰度提高,有助于提高豹纹鳃棘鲈对蛋白质和碳水化合物等营养物质的利用率,以及次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢。就GZPH2提高肠道菌群功能的机理而言,功能性菌群内部的协同增效作用(正相关)及其与致病菌的抑制作用(负相关),同时发挥作用,进而达到抑制致病菌并增加功能性菌群相对丰度的效果。如乳杆菌属(Lactobacillus)与伯克氏菌属(Burkholderia)的负相关关系(p<0.05),以及严格梭菌属(Clostridium＿sensu＿stricto＿1)与乳杆菌属的正相关关系(p<0.05)。(3)再次,应用LC-MS/MS技术,开展豹纹鳃棘鲈肠道菌群代谢组学研究。与对照相比,GZPH2促进了豹纹鳃棘鲈肠道代谢向更好的模式转变,有机酸等代谢物含量提高,并在戊糖和葡萄糖醛酸转换、甘油磷脂代谢、精氨酸生物合成、亚麻酸代谢通路显著富集,对照组代谢活动的紊乱影响了功能性中间产物的合成,进而对豹纹鳃棘鲈的免疫能力有潜在威胁。高浓度GZPH2有助于调节肠道代谢水平,清除机体氧化代谢产物,促进精氨酸和功能性脂肪酸以及葡萄糖醛酸、苯乳酸等功能性物质的合成,对豹纹鳃棘鲈肠道健康有正面影响。低浓度GZPH2也有同效,但在葡萄糖醛酸合成方面有所不及。(4)最后,运用统计学分析,开展豹纹鳃棘鲈肠道菌群微生物组学与代谢组学的关联性研究。结果发现,一方面,GZPH2改变了豹纹鳃棘鲈肠道菌群结构,影响了机体代谢途径生化反应中的电子传递,与戊糖与葡萄糖醛酸转换、甘油磷脂代谢、药物代谢-细胞色素P450等途径的差异代谢物产生相关性(p<0.05);另一方面,GZPH2引起了代谢产物变化,代谢产物又反作用于肠道菌群,如球二孢菌素等与假单胞菌属、Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia之间的显著负相关关系(p<0.05)。综合以上分析,很明显,GZPH2无论在应用还是停用期间,对豹纹鳃棘鲈肠道微生态均具有效的调节作用。它通过提高有益菌数量,减少有害菌累积,促进功能性代谢物产生,增强机体抗氧化能力,达到维护鱼类机体健康功能的作用。因此可以说,本项研究在促进豹纹鳃棘鲈健康绿色养殖、保障食品安全方面,具有一定的现实意义。