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前言银屑病(psoriasis)是在多基因遗传背景下发生的以T细胞为主的多种免疫细胞共同参与的慢性复发性皮肤病,典型皮损为鳞屑性红斑。目前认为银屑病的发病机制主要表现为由T细胞介导的角质形成细胞(keratinocyte, KC)为靶点的免疫应答反应。在T细胞因子作用下,KC可能会出现异常的增殖和分化；KC通过表达细胞因子参与T细胞的记忆和活化。T细胞和KC分泌的细胞因子在银屑病中形成复杂的细胞因子网络可能导致银屑病特有的免疫病理损伤。Th17细胞是一种新认识的CD4+T细胞亚群,因其分泌IL-17(IL-17A)而命名,已经证实Th17细胞在银屑病和其它自身免疫性疾病发病机制中起重要作用。TGF-β、IL-1β、IL-6、IL-21和IL-23参与Thl7细胞的分化,其效应因子IL-17可促进角质形成细胞产生VEGF、IL-8、GM-CSF、TNF-α、CXCL10等细胞因子,这些炎症因子相互作用可能会诱发和加重银屑病。紫草为药典收载的临床常用传统中草药,属于紫草科多年生草本植物,根用于药,具有抗炎、抗肿瘤、保肝、调节免疫、避孕、杀菌和抗病毒等作用。紫草水提物、醇提物、醚提物都有此作用,常作为治疗银屑病主要的药物。紫草主要成分有两大类,一类为脂溶性的萘醌类色素,主要包括紫草素及其衍生物；另一类为水溶性成分紫草多糖,其多糖含量在2%左右。本实验拟通过观察银屑病患者血清中IL-17的含量变化及研究一定浓度IL-17对HaCaT细胞分泌VEGF、IL-6及IL-23的影响和紫草素的干预作用,试图探讨细胞因子在银屑病发病中的作用及紫草素治疗银屑病可能的机制。材料与方法一、研究对象和主要试剂(一)研究对象1、银屑病患者组中国医科大学附属第一医院皮肤科银屑病住院患者,经临床确诊为银屑病,共23名,男17名,女6名,年龄23-74岁(平均49±15岁)。所有患者均无其它自身免疫性疾病史。2、正常对照组自愿献血者16名,性别年龄与患者组匹配。无银屑病及其它自身免疫性疾病史。所有研究对象签订知情同意书。根据PASI (psoriasis area and severity index,银屑病面积和严重程度指数)标准,将银屑病患者分为轻度、中度及重度皮损患者。3、HaCaT细胞皮肤角质形成细胞株HaCaT细胞为德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠。(二)主要试剂1、主要试剂IL-17购自美国Peprotech公司；紫草素购自日本和光(Wako)生物试剂公司；环孢素A购自德国Merck公司；CCK-8购自日本同仁化学研究所；DMEM培养液、胎牛血清、PBS及1%青链霉素购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶购自美国GIBICO公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国AMRESCO公司；人IL-17定量ELISA试剂盒购自美国Rapidbio公司；人VEGF定量ELISA试剂盒及人IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；人IL-23定量ELISA试剂盒购自美国R&D公司；96孔细胞培养板及12孔细胞培养板购自美国BD Pharmingen公司。2、主要仪器CO2恒温培养箱、超净工作台、倒置相差显微镜、低温超速离心机、台式高速离心机、-80℃深低温冰箱、-20℃冰箱、4℃冰箱、电脑压力蒸汽灭菌器、电热恒温水箱、酶标仪。二、实验方法1、将实验细胞分为IL-17刺激组及药物组,HaCaT细胞以每孔1×105个／ml接种于12孔板,在不同处理条件下培养3天。每组平行设3个复孔,重复培养6次细胞,分别检测。(1)IL-17刺激组分为4组：空白对照组(DMEM培养24h)、IL-17刺激24h组(IL-17 80ng／ml+DMEM培养24h)、IL-17刺激36h组(IL-17 80ng／ml+DMEM培养36h)、IL-17刺激48h组(IL-17 80ng/ml+DMEM培养48h)。(2)药物组分为4组：空白对照组(DMEM培养24h)、紫草素+IL-17组(紫草素50umol／L+IL-17 80ng／ml+DMEM培养48h)、环孢素A+IL-17组(环孢素A 10umol／L+IL-17 80ng／ml+DMEM培养48h)、IL-17组(IL-1780ng/ml+DMEM培养48h)。2、ELISA法检测银屑病患者血清中IL-17的含量及IL-17刺激组、药物组VEGF、IL-6、IL-23的含量。3、CCK-8检测药物组HaCaT细胞活力。实验结果1、与正常人相比,银屑病患者血清中IL-17含量显著升高(18040.23±8045.54v.s 2954.86±1433.74,P<0.05)。根据银屑病PASI评分,轻度、中度及重度皮损的患者血清中IL-17平均相对表达量分别为3466.37±1294.77、7928.59±1143.94、20319.74±6260.72,与轻、中度皮损的银屑病患者相比,重度皮损的患者血清中IL-17含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001)。2、IL-17刺激组及药物组ELISA检测结果(1)IL-17刺激组HaCaT细胞培养上清中各因子的表达水平80ng／ml IL-17刺激HaCaT细胞0h、24h、36h、48h后VEGF平均相对表达量分别为340.76±57.80、333.54±56.58、510.11±107.62、791.70±55.85；IL-6平均相对表达量分别为107.50±23.80、144.48±44.26、210.48±30.02、220.37±35.74；IL-23平均相对表达量分别为96.49±4.35、62.37±8.50、121.35±13.10、161.91±12.77；不同时间IL-17刺激组HaCaT细胞培养上清中VEGF、IL-6、IL-23的表达高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。(2)药物组HaCaT细胞培养上清中各因子的表达水平80ng/ml IL-17、50umol／L紫草素和10umol／L环孢素A共同作用HaCaT细胞48h后空白对照组、紫草素+IL-17组、环孢素A+IL-17组及IL-17组中VEGF平均相对表达量分别为328.45±35.97、511.22±50.29、490.47±33.15、798.42±99.52；IL-6平均相对表达量分别为107.95±20.04、133.88±33.85、135.57±26.41、220.59±34.66；IL-23平均相对表达量分别为100.07±10.25、119.16±16.47、129.28±13.36、178.63±27.01；紫草素及环孢素A处理组VEGF、IL-6、IL-23的表达均低于IL-17组,差异具有统计学意义(P<0.001)。3、用CCK-8检测药物组HaCaT细胞活力紫草素处理组细胞的存活率(%)为101%,环孢素A处理组细胞的存活率(%)为101%,药物组中空白对照组、紫草素+IL-17组、环孢素A+IL-17组及IL-17组的细胞活力OD值分别为1.115±0.011、1.125±0.142、1.125±0.085、1.126±0.129,各组细胞活力无明显差异(P>0.05)。结论1、银屑病患者血清中IL-17含量显著升高。2、IL-17刺激HaCaT细胞后VEGF、IL-6及IL-23的表达量升高,并呈时间依赖性,IL-17具有促进炎症因子分泌的作用。3、紫草素可抑制IL-17促进炎症因子分泌的作用。