论文部分内容阅读
目的:冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting,CABG）是广泛应用于心脏外科的术式之一,临床上主要用于目前发病率一直居高不下的冠心病的外科治疗。在CABG手术过程中,心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI）难以避免。MIRI发生之后可引起一系列炎症因子活化,后者可借由全身血液循环到达远处的靶器官并起到伤害作用,尤其是中枢神经系统。近年来,越来越多的研究阐述了心肌缺血再灌注与脑损伤之间的关系。也有文献报道,心肌缺血再灌注损伤能够引起认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction,POCD）。在日常的外科临床治疗工作中,我们也发现随着现代手术技术及手术器械日新月异的改进,CABG临床上术后生存率及生活质量已经得到极大的提高,术后并发症得到了有效控制,但术后神经功能损伤以及POCD的发生却日益显现。激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system,KKS）是公认的炎症调节系统,其中缓激肽B1受体（Bradykinin B1 receptor,B1R）、缓激肽B2受体（Bradykinin B2receptor,B2R）作为调控血管新生及炎症反应信号通路上游的关键靶点而发挥举足轻重的作用。机体正常生理状态下,B1R在组织中几乎不表达;但当组织功能发生损伤后,B1R表达水平快速上升,并进一步发挥其生物学作用,因此称B1R为损伤诱导型受体。右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）是具有强效能的α2肾上腺素能受体激动剂,是一种目前临床许多科室常用的麻醉辅助用药。近年来各种研究表明,其具有镇静、镇痛、抗焦虑以及脑保护作用,但确切机理仍需进一步研究。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）是一族含有丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶。p38MAPK通路是其级联信号传导通路之一,参与了应激状态下多种过程。近来有研究推测缓激肽B1受体主要与p38MAPK通路激活有关。因此我们认为,MIRI过程中炎症因子水平的变化,很可能会激活KKS引发一系列病理生理变化。本课题旨在研究心肌缺血再灌注所致远隔器官功能损伤,探讨缓激肽受体B1R在心肌缺血再灌注损伤后脑组织中的动态变化。并通过使用右美托咪定抑制炎症反应及凋亡,以期达到中枢神经系统保护的作用,并进一步研究其可能机制,为临床工作中心脏外科手术麻醉后患者认知功能障碍的药物治疗提供一定思路。研究方法:1.选用SPF级SD大鼠72只,体重200±20g,随机分组分为2组:每组36只。MIRI组大鼠采用冠状动脉左前降支结扎法造模,假手术组仅暴露心脏,不做其他操作。于再灌注7d行水迷宫实验检测大鼠认知功能改变;于2h、6h、24h、72h、7d时间节点,各组随机选取6只大鼠,腹腔注射戊巴比妥钠（100mg/kg）麻醉,腹主动脉穿刺采血,用于ELISA法检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量。采血后冰上取全脑组织,将全脑沿大脑纵裂等分,左侧大脑用于免疫荧光法检测B1R、p38MAPK磷酸化蛋白的表达;右半脑组织分离额叶及颞叶皮质,液氮冻存,之后转运冻存于-80℃冰箱中,分别用于ELISA法检测脑组织上述炎症因子含量及Western-blot法检测B1R、p38MAPK及其磷酸化蛋白的表达水平。2.选用SPF级SD大鼠36只,体重200±20g,随机分组分为3组,分别为:假手术组,MIRI+生理盐水（NS）组,MIRI+右美托咪定（DEX）组。复制MIRI大鼠模型同前。各组大鼠麻醉方法同前,MIRI+NS组大鼠于术前尾静脉推注NS 1ml,然后用微量注射泵以1ml/h速度持续泵入NS直至再灌注结束。MIRI+DEX组大鼠于术前尾静脉推注右美托咪定5μg/kg（5μg/ml）,然后用微量注射泵以5μg/kg/h的速度持续泵入直至再灌注结束。再灌注24h后,取材固定,同上。Western-blot法检测B1R和p38MAPK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化形式蛋白表达水平,ELISA法检测血清中及脑组织中炎症因子含量,免疫荧光法检测B1R表达,Tunel法测定脑组织凋亡水平。再灌注7d后,行Morris水迷宫行为学实验。3.选用SPF级SD大鼠36只,体重200±20g,复制MIRI大鼠模型同前,然后将MIRI模型大鼠随机分为6组:MIRI+NS组,MIRI+DEX组,MIRI+SB203580组,MIRI+DEX+SB203580组,MIRI+des-Arg9-BK组,MIRI+DEX+des-Arg9-BK组。MIRI+NS组大鼠及MIRI+DEX组大鼠用药方式同前,补充的是MIRI+NS组大鼠在术后再灌注12h尾静脉再次注射NS 1ml。MIRI+DEX组大鼠术后再灌注12h尾静脉再次注射右美托咪定5μg/kg（5μg/ml）;MIRI+SB203580组大鼠于再灌注前,静脉注射SB203580（5mg/kg）,术后再灌注12h尾静脉再次注射SB203580（5mg/kg）;MIRI+DEX+SB203580组大鼠右美托咪定的术前及术中用法同前;再灌注前,静脉注射SB203580（5mg/kg）,术后再灌注12h尾静脉再次注射SB203580（5mg/kg）,间隔20min后,尾静脉再次注射右美托咪定5μg/kg（5μg/ml）;MIRI+des-Arg9-BK组于再灌注前,静脉注射des-Arg9-BK（100nmol/kg）,术后再灌注12h尾静脉再次注射des-Arg9-BK（100nmol/kg）;MIRI+DEX+des-Arg9-BK组大鼠右美托咪定的术前及术中用法同前;再灌注前,静脉注射des-Arg9-BK（100nmol/kg）,术后再灌注12h尾静脉再次注射des-Arg9-BK（100nmol/kg）,间隔20min后,尾静脉再次注射右美托咪定5μg/kg（5μg/ml）。于再灌注24h各组大鼠麻醉后取材同上。ELISA法检测炎症因子含量;免疫荧光法及Western-blot法检测上述蛋白及其磷酸化形式的表达水平,实验操作同上。结果:1、水迷宫检测结果显示:与假手术组比较,MIRI组、MIRI+NS组、MIRI+DEX组大鼠逃避潜伏期明显延长,穿越平台次数明显减少;Dex干预后水迷宫数据发生与上述结果相反趋势的变化,提示认知功能有所改善。2、MIRI组大鼠各时间点脑组织中B1R、p38、p-p38蛋白表达水平升高,24h达最高水平。3、MIRI组大鼠各时间点脑组织及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高;再灌注24h上述指标含量达峰值;再灌注72h、7d组含量显著降低。4、与假手术组比较,MIRI+NS组、MIRI+DEX组大鼠脑组织及血清中炎症因子含量显著升高,大鼠脑组织中B1R和p38MAPK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化形式蛋白表达水平显著升高;与MIRI+NS组大鼠比较,MIRI+DEX组上述各指标表达水平显著降低。5、与MIRI+NS组比较,MIRI+SB203580组、MIRI+SB203580+DEX组大鼠脑组织中B1R和p38MAPK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化形式蛋白表达水平显著降低,MIRI+des-Arg9-BK组显著增高;与MIRI+DEX组和MIRI+SB203580组比较,MIRI+SB203580+DEX组大鼠脑组织及血清中各指标显著降低,MIRI+des-Arg9-BK组显著增高;与MIRI+SB203580+DEX组比较,MIRI+des-Arg9-BK组、MIRI+des-Arg9-BK+DEX组大鼠脑组织及血清中上述炎症因子含量显著增高,大鼠脑组织中上述蛋白表达水平显著增高;与MIRI+des-Arg9-BK组比较,MIRI+des-Arg9-BK+DEX组大鼠上述指标显著降低。结论:心肌缺血再灌注能够导致脑组织损伤,在再灌注24h时,脑内炎症反应及B1R受体表达水平达到峰值,p38MAPK信号通路被活化。右美托咪定可能通过下调B1R的表达,进而抑制p38MAPK信号通路的过度活化,从而发挥对MIRI大鼠的抗炎作用。