印楝素具有很好的昆虫生长发育抑制活性,研究它对昆虫组织发育的影响对于创制新型昆虫生长发育调节剂具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的小分子非编码RNA,通过对目标mRNA的抑制而发挥调节作用。本文以模式昆虫黑腹果蝇(Drosophila melanogastr)为试虫,在建立昆虫miRNA检测方法的基础上,系统研究了印楝素对bantam、miR-14和miR-2α等3种果蝇miRNA表达的调控作用及其对Caspase-3和几丁质酶活性的影响,首次从对miRNA调控的角度,探讨了印楝素干扰昆虫表皮形成发育的作用机制。论文结果为研究植物源农药调节昆虫生长发育作用机制提供了新角度,并为今后研究设计以miRNA为靶点的新型农药提供重要信息。　　 根据miRNA特有的结构,反转录所用引物序列在Oligo-dT的3’端增加了一个碱基,以锚定反转录引物,配合实时定量PCR引物,建立了改进的miRNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测果蝇miRNA的方法模型,以此方法模型检测了果蝇3种miRNA,即bantam,miR-2α和miR-14的相对表达量,结果表明,此方法可行有效。　　 运用此方法模型检测了印楝素2.0mg/L处理后凋亡相关miRNA bantam、miR-14和miR-2α在果蝇11个生长阶段中的表达量,结果显示,miR-2α表达量在处理后呈现整体高于对照的现象,bantam表达量因发育阶段不同而与对照相比有升高或降低,而印楝素对miR-14的表达则呈显著的抑制作用,特别是从3龄幼虫到成虫阶段miR-14的表达量较对照持续显著下调。试验结果表明印楝素处理能够显著影响bantam、miR-14和miR-2α等3个miRNA的表达,尤其对miR-14的表达起到了显著抑制的作用。　　 根据miRNA表达量的试验结果,进一步研究了印楝素以0.5、1.0、2.0、4.0mg/L处理对miR-14基因调控的Caspase-3酶活性的影响,结果表明,各处理与对照试虫中Caspase-3酶活性峰值均出现在3龄幼虫、预蛹和新蛹阶段,各处理酶活性均显著高于对照,随着药物处理浓度的升高Capase-3酶活性增加,在2.0mg/L处理时达到峰值。　　 运用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)测定相同发育阶段果蝇的几丁质酶活性,结果表明,印楝素以1.0、2.0、4.0mg/L分别处理后果蝇几丁质酶活性均显著高于对照,且酶活性随印楝素处理浓度的升高而升高,2.0mg/L和4.0mg/L处理时活性达到最高,3龄幼虫几丁质酶活性分别较对照上升29％和34％。相对应的是,印楝素处理后,果蝇表皮几丁质含量均显著低于对照,几丁质含量随印楝素浓度升高而降低,在2.0和4.0mg/L,处理时达到最低,3龄幼虫较对照分别降低35％和41％。　　 形态学观察结果表明,印楝素2.0mg/L处理1龄幼虫后,幼虫取食量减少,中毒幼虫外观粗细不一,蜕皮后身体弱表皮易破,虫体透明度降低。中毒蛹粗糙,蛹壳皱缩程度大,部分个体比对照小。透射电镜观察结果表明,印楝素2.0mg/L,处理后,果蝇2龄和3龄幼虫表皮的几丁质层厚度和层数以及致密程度均较对照减少。说明印楝素处理影响了几丁质的形成,减少了果蝇表皮几丁质层的厚度,从而调控昆虫表皮的形成。　　 根据试验结果,本文推测认为,印楝素作用于昆虫,可能首先抑制miR-14等相关miRNA的表达,增强了Caspase.3酶活性,加速表皮几丁质层的凋亡降解,造成’昆虫表皮几丁质层结构的破坏;同时,刺激几丁质酶活性增强,造成表皮几丁质层非正常地加速降解,使几丁质含量显著降低。两个途径共同作用干扰了表皮几丁质层的正常形成,从而抑制昆虫生长发育。