斜纹夜蛾是全球性热带亚热带地区的主要鳞翅目害虫之一。对昆虫中肠基因和蛋白的分析一直是各国科学家和农药生物技术公司的重点研究领域。固醇转运蛋白(Sterol Carrier Protein)是参与胆固醇吸收和转运的一个重要蛋白。胆固醇不仅是昆虫细胞膜成分，更是蜕皮激素生物合成的前体，并参与各种生理活动。昆虫由于缺乏胆固醇生物合成的关键酶鲨烯合酶和羊毛甾醇合酶，故不能从头自身合成胆固醇，只能从宿主植物中吸收。因此，固醇转运蛋白作为胆固醇转运载体，吸收运输胆固醇，供幼虫正常生长发育需要。本实验室早期的研究表明，斜纹夜蛾固醇转运蛋白(SlSCPx)是一个胆固醇转运载体，RNA干扰该基因表达导致幼虫的蜕皮延迟和生长缓慢，超表达SlSCPx蛋白则增加Spli221细胞株对胆固醇的吸收。对于斜纹夜蛾固醇转运蛋白的结构与功能关系的研究尚未见报道。本研究对该蛋白结构与功能及作用机理进行进一步的探究，并对该蛋白在农业害虫防治方面的可能应用进行了初步探讨。获得了如下主要结果:　　(1)为了明确固醇转运蛋白的功能，首先解析了该蛋白的三维空间结构。我们以人类SCP-2蛋白为模板，利用Discovery Studio2.5软件模拟了SlSCPx-2的初始三维空间结构。SlSCPx-2三维结构由5个α-螺旋和5个β-折叠区域组成，顺序依次为α1-α2-βⅠ-βⅡ-βⅢ-βⅣ-α3-α4-βⅤ-α5。5个β-折叠以反向平行方式排列成一个平面，依次顺序是Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ-Ⅳ-Ⅴ，5个α-螺旋覆盖在β-折叠面上方，整个β-折叠面和α-螺旋交界面形成一个疏水口袋以结合底物，βⅤ和紧接在它之前的α4-螺旋和之后的α5-螺旋形成一个三角形底物结合口袋的入口。在这个初始模型中，α5-螺旋向内部收拢，明显缩小了底物的结合口袋而不能容纳任何脂类或甾醇，不能完全显示该蛋白的天然构象，更加不利于后期的底物对接和抑制剂的筛选。　　(2)为了获得更加合理且接近于天然构象的SlSCPx-2蛋白的三维结构，使用Amber8.0软件的SANDER模块对初始模型进行动力学优化。将AeSCPI1抑制剂分子对接迸SlSCPx-2蛋白疏水结合口袋处形成复合物SlSCPx-2-AeSCPI-1，该AeSCPI-1分子可以保持复合物动力学优化过程中蛋白结合口袋的大小，动力学优化之后，取平衡的18900-21000 ps的平均结构作为SlSCPx-2最后的优化结构。对优化后的SlSCPx-2-AeSCPI-1复合物模型的拉曼图谱分析结果显示其最适允许区的氨基酸残基占到92.85％以上，允许区的氨基酸残基占到7.14％，而不允许区为0。整个β-折叠面和α-螺旋交界面形成一个大的疏水口袋结合底物。结果表明，所建立的模型SlSCPx-2的三维结构是可靠的。　　(3)为进一步分析哪些底物是SlSCPx蛋白的最适结合底物，从天然脂类数据库Lipidbank中下载462种脂肪酸和731种甾醇，使用SYBYL-7.3软件中的Surflex-dock模块对优化后的SlSCPx-2蛋白进行脂肪酸和甾醇的虚拟筛选。结果显示，约10％的对接甾醇与该蛋白具有高结合力，大都存在于植物中，如α-spinasterol（菠菜甾醇），lumisterol（光甾醇），campesterol（菜油甾醇），stigmasterol（豆甾醇），β-sitosterol（β-谷甾醇）和chondrillasterol（粉苞苣甾醇）等;约有10％的对接脂肪酸与该蛋白具有高亲和力，大部分是16C-22C的中长链脂肪酸，在植物中普遍存在，如trans-brassidic acid（二十二碳烯酸），palmitic acid（软脂酸），stearic acid（硬脂酸），oleic acid（油酸），linoleic acid（亚油酸）和arachidonic acid（花生四烯酸）。这些结果显示，SlSCPx蛋白可与植物中多种甾醇和脂肪酸结合，这与斜纹夜蛾生长发育所需的胆固醇来自体外食物摄取相一致。　　(4)为了利用体外间接ANS荧光替换实验来验证预测的SlSCPx-2三维结构及其与底物结合的正确性，体外表达了包含底物结合区在内的活性蛋白SlSCPx和包含底物结合区在内的SlSCP-2，并进行了纯化。纯化的SlSCPx蛋白与底物的体外结合实验结果表明，SlSCPx蛋白对胆固醇，硬脂酸，油酸，软脂酸，亚油酸，豆甾醇，花生四烯酸具有不同程度的结合亲和力，表明，所获得的SlSCPx-2三维结构以及以此进行的虚拟筛选方法是合理的，同时表明SlSCPx蛋白在胆固醇和脂肪酸吸收和转运中起着非常重要的作用。　　(5)为了确定SlSCPx与底物结合的关键氨基酸，利用PocketFinder口袋搜索软件预测了SlSCPx蛋白与底物结合的关键氨基酸。结果表明，F53，W66，F89，F110，I115，T128和Q131等氨基酸对于与底物结合是重要的。对这些氨基酸进行了定点突变实验，结果显示，F53，T128和Q131处于底物结合口袋的活性中心，在与底物结合形成蛋白-底物复合物中起重要作用。突变这些氨基酸残基导致蛋白结合脂肪酸和甾醇的亲和力不同程度的下降;W66，F89，F110通过形成π-π堆叠稳定了底物结合口袋的结构;I115对蛋白结合脂肪酸起重要的作用。　　(6)根据活性中心的关键氨基酸与底物结合的特性，使用SYBYL-7.3软件进行小分子先导化合物的筛选，从SPECS数据库虚拟筛选获得50种可能的抑制剂分子，选取其中打分高并且构型合理的5种抑制剂分子进行体外结合活性实验和体内生物学实验。以3，12，48μg/g的浓度添加到人工培养基中喂食斜纹夜蛾幼虫。体外结合活性分析结果表明， AG-664/14117324， AH-487/41731687和AG-205/36813059三种化合物能与SlSCPx蛋白结合，IC50值分别为2.58μM，4.30μM和23.88μM。体内喂食生物鉴定实验显示，AG-664/14117324和AH-487/41731687两种化合物分子在12和48μg/g的浓度下明显抑制幼虫的生长使幼虫体重下降;AG-205/36813059和AE-399/15104011在48μg/g的浓度下抑制幼虫生长。AG-205/07775053无论体外实验还是体内实验都都对与SlSCPx蛋白的结合和幼虫生长影响不大。这些结果说明，虚拟筛选可获得能抑制斜纹夜蛾幼虫的生长发育的抑制性化合物。　　(7)为研究蛋白结构与功能的关系，本研究还尝试了通过蛋白结晶来解析蛋白的三维空间结构。体外表达和纯化了全长SlSCPx、仅含胆固醇底物结合区的SlSCP-2，以及体外表达了SlSCP-2的两个截短片段SlSCP-2-cutoff1和SlSCP-2-cutoff2。并获得了其中的SlSCPx的针状粗晶。但是未能最终获得可用于X-射线衍射的晶体结构解析蛋白结构。