铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属多年生附生草本植物,是一种名贵的中药材。但由于铁皮石斛自身特殊的种胚发生机制——原球茎发育机制,即种子成熟时胚胎还停留在未分化成熟的球形原胚阶段,种子萌发按照原球茎的发育进程进行,这种发育机制需要大量外源营养物质补充才能顺利进行,而在自然条件下难以满足萌发条件,导致种子萌发率低;再加上人类大量采摘,导致野生资源缺乏,现已沦为濒危物种。本研究以铁皮石斛为材料,研究了铁皮石斛原球茎发生的形态学过程、铁皮石斛转录组、原球茎发育不同时期和不同组织的差异表达基因、DoTrxL2的序列分析这四个方面。主要实验结果如下:(1)本文通过石蜡切片和扫描电镜对铁皮石斛原球茎发育过程中的形态变化进行观察,鉴定出了原球茎发生过程中多个时期的形态特征。我们发现,原胚活化膨胀过程中,需要突破内外两层种皮;在原球茎形成时期的细胞已经具有极性,并在原球茎底部出现绒毛状的毛细胞;原球茎原分生组织的发育为不对称发育,并在原球茎底部出现气孔;原分生组织发育成熟后,在锥状突起腹部中间出现一个细胞断层,可能是原分生组织与顶端分生组织细胞的分界。(2)本文对铁皮石斛原球茎过程中的种胚活化突破种皮时期(seed embryo activation and breakthrough testa,P1)、原球茎形成时期(protocorm,P2)、原分生组织形成时期(promeristem,P3)、顶端分生组织形成时期(SAM,P4)、椭球型原球茎时期(spheroidicity protocorm,P5)、叶原基维管系统形成时期(leaf primordium and vascular system,P6)、根端分生组织形成时期(RAM,P7)共7个不同发育时期和类原球茎、愈伤组织以及成苗的转录组进行高通量测序。完成P1-P5时期的Illumina RNA-seq二代测序,每个时期设置三个重复共15个样品,共得到106.81 Gb Clean Data,Q30达到91.20%。将所有样品等量混合,使用PacBio RS II完成混合样品F01(Full-01)的三代转录组测序,一共获得了13.86Gb数据。用二代测序数据对三代测序数据进行校正,共获得ROI(reads of insert)的数目共有381,755条,获得全长非嵌合(FLNC,full length readsnon-chimeric)的序列共有194,404条。使用SMRT Analysis软件的RS_IsoSeq模块对全长序列进行聚类分析,共得到79,477条一致性转录本序列,使用非全长序列校正后得到60,726条高质量全长转录本序列。对校正后的新转录本进行结构和功能注释分析,结构分析包括可变剪切分析、SSR分析、SNP位点分析;将得到的转录本序列与NR、Swissprot,GO、COG、KOG、Pfam、KEGG数据库比对,一共注释了27,107个基因。(3)我们将铁皮石斛种子原球茎在发育不同时期进行转录组测序,得到铁皮石斛转录组数据库。根据转录组数据筛选差异表达基因21,492个,并将这些基因进行GO和KEGG分析,结果发现差异表达基因注释最多的是代谢活动,这表明在铁皮石斛原球茎发育过程中,代谢活动活跃,差异表达基因调节着原球茎的生长和发育。对植物信号转导通路中,与生长素反应因子ARF(auxin response factor,ARF)有关的差异表达基因,在P1 vs P2、P2 vs P3、P3 vs P4、、P4 vs P5时期的表达趋势是:先上调,再下调、再上调,最后趋于平稳,这与原球茎发育过程中的变化是一致的。根据Pfam注释结果,筛选出78条注释为Trx家族的基因,其中有11条在原球茎发育的不同时期差异表达,并初步分析了这些差异表达基因在原球茎发育不同时期的差异表达情况。(4)运用RACE技术和巢式PCR技术克隆出了铁皮石斛硫氧还蛋白超家族基因DoTrxL2(Thioredoxin like 2,DoTrxL2)。将测序后的序列进行分析表明,DoTrxL2基因的开放阅读框(ORF)长度为639bp,编码了213个氨基酸,其中包含了一个硫氧还蛋白家族保守的CXXC功能结构域,可通过两个半胱氨酸的双硫键得失电子,起到氧化还原作用。分子进化分析显示,DoTrxL2同小兰屿蝴蝶兰、石刁柏亲缘关系较近。qRT-PCR分析显示,DoTrxL2在铁皮石斛原球茎不同发育时期及不同组织中均差异表达,其中,在原球茎形成时期的表达量较高,说明该基因对原球茎形成有着促进作用;而在不同组织的种子和花中表达量高,表明该基因对植物组织的生殖发育具有重要调控作用。