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乳铁蛋白(LF)是由哺乳动物乳腺和其他外分泌腺产生的一种铁结合糖蛋白,广泛存在于乳汁、唾液、眼泪等分泌物中,它具有抗病毒、杀菌、免疫调节、基因转录活化等多种生物学活性。随着乳铁蛋白被普遍关注和广泛重视,人们发现牛乳铁蛋白是常见高等哺乳动物分泌的乳铁蛋白中生物活性最强的,并且多种动物乳铁蛋白的许多生物学功能都与它们的N-端(N-lobe)密切相关,特别是与其N-端的乳铁蛋白素(Lfcin)相关。
毕赤酵母是近年来发展起来的一种新型酵母表达系统,它兼有原核细胞的生长特性和分子遗传背景,又有真核生物的特性,可以对外源蛋白质进行蛋白质糖基化、二硫键形成等翻译后修饰,在过去的20年中已经有超过300种不同的蛋白质在毕赤酵母中实现了成功表达。
目的：本实验拟通过基因工程技术建立一个体外高效表达系统。为深入的了解牛乳铁蛋白N-端基因和牛乳铁蛋白素(LfcinB)基因的生物学活性和应用发展空间,为该蛋白的以后研究提供基础。
方法：从泌乳期奶牛的乳腺组织中提取其总RNA,根据GenBank中已经报道的牛乳铁蛋白的mRNA(NO:NM 180998)合成引物,运用RT-PCR的方法克隆了LfcinB和牛乳铁蛋白N-lobe碱基序列,将这二者克隆到pGM-T载体上并对其进行酶切和测序鉴定,测序正确的被分别命名为pGM-LfcinB和pGM-N-lobe。挑取pGM-N-lobe菌株放大培养提取质粒后用EcoR I和Xba I双酶切切下牛乳铁蛋白N-lobe,与此同时用EcoR I和Xba I双酶切的毕赤巴斯德酵母分泌表达载体pPICZαA,在T4 DNA连接酶的作用下使二者连接,经酶切鉴定和序列测定确认N-lobe碱基序列插入多克隆位点并且开放性阅读框正确后,Sac I线性化重组质粒,用电击的方法转入毕赤酵母GS115中。30℃培养数天后从YPDS平板上挑取具有ZeocinTM抗性的克隆,对比在MM和MD平板上的生长情况确定转化子的表现型。Lyticase酶裂解酵母细胞,以裂解后暴露的酵母基因组为模板,采用PCR方法确认有N-lobe基因整合到酵母基因组中。将鉴定有N-lobe基因整合酵母转化子接种到BMGY/BMMY培养基中发酵培养,用甲醇诱导,收集诱导不同时间的上清和细胞沉淀,用三氯醋酸(TCA)沉淀上清,用SDS-PAGE和抑菌实验两种方法检测目的蛋白的表达情况。
结果：将这两段碱基序列分别克隆入pGM-T载体测序结果表明：前者长87bp与参考序列(登录号为:NM 180998)的同源性为100％；后者长1028bp与参考序列的同源性为99.7％：对含有N-lobe的酵母转化子的诱导表达结果检测表明牛乳铁蛋白N-lobe在毕赤巴斯德酵母GS115菌株中未能成功表达。
结论：本实验克隆了牛乳铁蛋白素和牛乳铁蛋白N-lobe的碱基序列,并且构建了N-lobe碱基序列酵母表达质粒,虽牛乳铁蛋白N-lobe未能在宿主菌中成功表达,但探索了毕赤酵母生长、转化、筛选、诱导表达及蛋白检测等一系列条件,为后继实验奠定了基础。