本研究主要是对手工克隆(HMC)法在牛体细胞核移植中应用的各个技术环节进行探讨尝试。研究发现，利用切割半卵法去核，徒手切割卵母细胞的存活率与机械切割的差异不显著(85.6％vs 90.3％，P＞0.05)。采用聚乙二醇(PEG)对两个半卵胞质体与供体细胞进行融合，50％的PEG的融合率与45％、55％和60％PEG的融合率差异显著(39.3％vs 0％，39.3％vs 16.7％，39.3％vs 5.3％，P＜0.01)。对半卵胞质体-半卵胞质体-供体细胞进行一次性电融合时，参数二(AC 3.0V，12μs；DC 100V，30μs×1)与参数一(AC 3.0V，12μs；DC 90V，30μs×1)的融合率差异不显著(63.4％vs 55.2％，P＞0.05)。对半卵胞质体-供体细胞，半卵胞质体(融有供体细胞)-半卵胞质体进行融合时，在交流电压的功率和施用时间(AC 3.0V，12μs)相同的情况下，适当提高直流电压(分别将2次融合的DC电压由60V和40V相应升高到70V和50V)可极显著地提高克隆胚胎的总融合效率(55.6％vs 73.2％，P＜0.01)。采用参数二电融合胚胎的囊胚率与采用50％的PEG融合胚胎的囊胚率差异显著(11.2％vs 0％，P＜0.01)，而与两次融合法参数四的重构胚的囊胚率差异不显著(11.2％vs 4.9％，P＞0.05)。采用2μmol／L的离子霉素对去透明带的卵母细胞进行孤雌激活时，其囊胚率显著高于5.0μmol／L和0.5μmol／L的组(29.4％vs 8.3％，29.4％vs 9.4％，P＜0.01)，与3.5μmol／L的组差异不显著(29.4％vs 19.1％，P＞0.05)。对于去透明带胚胎的培养体系，微穴法与微滴法的分裂率差异不显著(61.3％vs 71.7％，P＞0.05)，而囊胚率差异极显著(44.0％vs 8.3％，P＜0.01)。试验结果表明，应用HMC法体细胞克隆牛，可采用徒手切割去核以降低成本；采用一次性或分步电融合法均适用于半卵受体与供体细胞的融合；用离子霉素激活去透明带卵应采用较低浓度(2μmol／L)；常规的微滴培养法不适用于无透明带的牛胚胎体外培养，而应采用微穴法培养。