论文部分内容阅读
目的： 本实验旨在探究Tyro3、Axl受体及其配体Gas6、ProS对炎症反应的作用及其机制，以及CS-CNT靶向递药系统的制备。 方法： 1.构建Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒。GenBank中查找小鼠Tyro3和Axl基因的mRNA序列，由公司设计引物序列，RT-PCR扩增Tyro3和Axl基因的全长片段，酶切，与空质粒pEGFP-N1连接。鉴定方法采用测序和双酶切。 2.CS-CNT的制备。将购买的CNT用浓硝酸和浓硫酸的混合液纯化、氧化，再与CS反应合成CS-CNT。 3.实验分组： ①实验组1：Tyro3、Tyro3+Lps、Tyro3+Gas6+Lps、Tyro3+ProS+Lps、Tyro3+Gas6+ProS+Lps ②实验组2：Axl、Axl+Lps、Axl+Gas6+Lps、Axl+ProS+Lps、Axl+Gas6+ProS+Lps ③空质粒组：pEGFP-N1、pEGFP-N1+Lps、pEGFP-N1+Gas6+Lps、pEGFP-N1+ProS+Lps、pEGFP-N1+Gas6+ProS+Lps ④单独配体组：BC、Lps、Gas6+Lps、ProS+Lps、Gas6+ProS+Lps 4.ELISA法检测细胞上清IL-6，IL-10，IL-33，TNF-α及TLR4的含量。 5.通过Real Time Q-PCR方法检测各组细胞中IL-6，MYD88，TNF-α，TLR4 mRNA的表达。 6.Western blot法检测各组细胞中SOCS1、SOCS3、TLR4和NF-κB蛋白的表达。 7.扫描及透射电镜观测CNT的修饰情况。 8.递药系统CS-CNT复合物的制备。 结果： 1、Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒构建 1.1.Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒的构建与鉴定 成功构建Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒，双酶切后琼脂糖凝胶电泳分别显示两条带，其分子量大小与预期大小相同。测序鉴定结果与Gen Bank中的小鼠Tyro3和Axl基因序列一致。 1.2.Tyro3-pEGFP-N1和Axl-pEGFP-N1质粒在RAW264.7小鼠巨噬细胞内表达 Tyro3-pEGFP-N1、Axl-pEGFP-N1和空质粒pEGFP-N1转入RAW264.7细胞24h后，荧光显微镜下可观测出绿色荧光，表明转染成功。 2、Tyro3、Axl对LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞的作用： 2.1.ELISA法检测结果：加入配体Gsa6和ProS预处理30min，对Lps刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞分泌的炎症因子IL-6，IL-33，TNF-α，TLR4具有明显的下调作用，并可促进抗炎因子IL-10的分泌。 2.2.Real Time Q-PCR方法检测结果：与实验各组对比，加入配体Gsa6和ProS预处理30min，可明显抑制IL-6、MYD88、TLR4和TNF-α的表达。 2.3.Western blot法检测结果：实验各组TLR4蛋白的表达在Lps刺激RAW264.7细胞后明显升高，但加入配体Gas6和ProS预处理，明显使TLR4和NF-κB的表达水平下降。同时，可促进SOCS1和SOCS3的表达。 3.CS-CNT的制备 通过实验及相关文献获取CS-CNT的最佳合成方法。 结论： Tyro3和Axl及其配体Gas6和ProS抑制Lps激活TLR4信号通路引发的炎症反应，TLR4的激活又抑制Gas6和ProS的表达，表明TLR4信号通路与Tyro3和Axl及其配体Gas6/ProS系统相互调节。