骨髓间充质干细胞(botle mesenchymal stem cells，BMSCs)，又称骨髓基质干细胞，是存在于骨髓基质中的一种干细胞，具备干细胞的两个重要特征：强的自我增殖能力和多向分化潜能，具有向骨、软骨、成纤维、脂肪、肌肉(心肌)及神经细胞等组织分化的潜能。 由于BMSCs具有取材方便，不存在免疫排斥问题，诱导分化的组织类型广泛等显著优点，因此受到普遍重视，临床应用前景极为广阔。1999年，Pittenger 等利用地塞米松、β-磷酸甘油等将体外培养的BMSCs成功诱导分化为成骨细胞，后人又在此基础上，利用组织工程学的原理，将诱导分化的细胞与载体结合，并成功的在动物体内异位成骨。随后，大规模的成骨诱导研究相继展开。 骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)，属于转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF—β)超家族中的成员，研究已显示，BMP-2具有良好的异位诱导成骨作用，经BMP-2基因转染的BMSCs具有明显增强的成骨转化作用。尽管目前对BMP-2诱导成骨的机理还未完全阐明，但多数学者认为：BMP-2自身既可以促进BMSCs向成骨细胞及成软骨细胞分化，同时又可以促进其它成骨因子在诱导成骨中的表达，从而增强诱导成骨作用。 全反式维甲酸(all-trans—retinoic—acid，ATRA)，是维生素A在机体内的氧化代谢产物，是一种脂溶性小分子，通过与细胞核上的两种受体结合，对多种细胞及组织的形态发生、增殖分化、生长发育、代谢及维持内环境稳定等方面具有广泛的牛物学作用。临床应用发现，虽然ATRA对多种恶性肿瘤具有增殖抑制和诱导分化的作用，但同时也有致骨质疏松的副作用，这说明ATRA对骨代谢也有调节作用。研究己显示：ATRA对体外培养的BMSCs具有诱导作用：可诱导BMSCs分化出神经元样细胞和脂肪样细胞。由此我们推测ATRA对诱导成骨的BMSCs肯定也会存在相关的调节作用。如何提高BMSCs诱导分化成骨的能力是目前研究的主要方向，本实验我们进行了：1，大鼠BMSCs的体外分离培养及诱导成骨；2，BMSCs体外诱导成骨机制的研究；3，BMSCs裸鼠体内诱导成骨的研究，目的是通过这些研究帮助我们认识大鼠BMSCs在各种不同培养基及诱导药物的作用下向成骨分化的能力以及TGT-β传导通路在诱导成骨中的作用。 目的： 1.研究在不同诱导条件下BMSCs诱导成骨的作用。 2.应用RT—PeR，研究TGF—β信号传导通路中各相关基因在BMSCs诱导成骨过程中的变化，从而了解BMSCs诱导成骨的机制。 3.建立动物模型，评估BMSCs与载体结合后的异位成骨能力。 材料和方法： 1.Wistar大鼠20只，取其双侧股骨胫骨，用全骨髓贴壁法进行大鼠BMSCs的体外分离培养，在不同培养条件下(对照组、骨诱导培养基、BMP-2、ATRA)，观察BMSCs诱导成骨过程中的生长特性； 2.诱导后在不同时间点对ALP、骨标志物以及TGF—β信号通路各基因表达进行检测； 3.以骨粉为载体，结合BMSCs，随机分组后植入6只裸鼠皮下饲养8周，观察生长情况，8周后取出，通过大体观察、X—ray、组织学观察等方法评估其成骨能力。 结果： 1.本研究成功地应用全骨髓贴壁法在体外分离培养出大鼠BMSCs，细胞生长良好、增殖能力强、具有多向分化潜能。细胞生长曲线显示：骨诱导培养基OM、BMP-2及ATRA均可不同程度抑制BMSCs牛长；碱性磷酸酶结果提示：OM及OM+BMP-2组ALP第6天即出现峰值，而CM、CM+BMP-2、CM+ATRA及0M+ATRA四组ALP表达升高则延期；钙结节染色证实：CM组及CM+ATRA组不能诱导成骨，而在CM+BMP-2、OM、OM+BMP-2、OM+ATRA四组可见到黑色钙结节分布，其中OM+BMP-2中形成的钙结节最多，而且钙结节颗粒大，密度高，折光性强，染色深，提示诱导成骨作用明显增强，而OM+ATRA形成的钙结节很少且形态甚微，染色较浅，不易辨别，提示诱导成骨作用明显抑制。脂滴染色结果证实：BMSCs经ATRA单独诱导可以分化为脂肪细胞。 2.应用RT—PCR检测TGF—β信号通路中多个基因在不同诱导条件下的表达发现：BMPr-Ⅰ、BMPz—Ⅱ、SMAD-5及MSX-2等基因在各组中表达有较明显差异，提示这几个基因表达的改变可能与不同的诱导成骨机制有关。而在ATRA两组中，两利BMPr及SMAD-5的表达均受到明显抑制。 3.动物实验结果证明：单纯细胞组和单纯的骨粉组均不能成骨，而OM+骨粉组和CM+骨粉组均可以诱导成骨。OM+骨粉组的诱导成骨能力明显强于CM+骨粉组。 结论： 1.在不同诱导培养条件下，BMSCs具有向不同细胞分化的潜能，BMP-2可促进OM诱导成骨的作用，ATRA单独作用时可以诱导BMSCs分化为脂肪样细胞，但不能诱导成骨。 2.BMP-2通过上调BMPr-Ⅰ和SMAD-5的表达量，同时调整BMPr-Ⅱ和SMAD-5的表达时空顺序，使二者峰值提前表达，从而实现诱导成骨。OM诱导成骨的机理较为复杂，可能与调整BMPr-Ⅱ和SMAD-5基因表达的时空顺序同时抑制MSX-2的表达有关。 3.OM+骨粉组的诱导成骨效果明显，最具有临床应用价值。