地下水是人类宝贵的淡水资源,是人类重要的饮用水水源之一。然而,随着工农业的迅速发展,地下水遭受到越来越严重的污染。邻苯二甲酸酯（PAEs,Phthalate esters）是地下水中主要的有机污染物之一,地下水中的PAEs对人类健康和生态环境具有巨大的潜在威胁。利用微生物修复PAEs污染地下水具有广阔的应用前景。研究PAEs的生物降解途径可为阐释地下水环境中PAEs的迁移转化规律提供有力的依据,弄清地下水中微生物降解PAEs的酶学响应机理可为污染地下水修复技术提供理论支撑。邻苯二甲酸二乙酯（DEP,Diethyl phthalate）是PAEs代表性污染物之一。本课题研究利用从江汉平原浅层地下水沉积物中分离到的一株DEP高效降解菌Sphingobium yanoikuyae SHJ,运用HPLC-HRMS技术研究了DEP在好氧与模拟浅层含水层氧气受限（限氧）条件下的生物降解动力学,识别和鉴定了代谢过程中的降解产物,推测出了DEP生物代谢途径;并利用第二代高通量测序平台Illumina Miseq测序和基于PacBio RS Ⅱ测序平台的第三代单分子测序技术,得到了该菌的全基因组序列,通过基因注释分析,获取其中与DEP降解相关的蛋白酶基因;采用相对和绝对定量的等量异位标签（iTRAQ）蛋白组学分析手段,研究了该菌在有无DEP存在下的差异蛋白,推测了参与DEP降解的蛋白酶;采用一系列柱分离技术,分离、纯化降解途径中的关键酶,以进一步确定该菌降解DEP的关键蛋白酶。通过以上研究得到了如下结论:（1）菌株SHJ的分离与鉴定及对DEP的降解动力学通过富集培养的方法,从被污染的江汉平原浅层含水层沉积物中分离出能够高效降解DEP的菌株,命名为SHJ,经16S rDNA基因测序鉴定为Sphingobium sp.。该菌株可以在模拟浅层含水层（拟地下水氧气受限、低温、静置、避光等特性环境）条件下利用DEP为唯一碳源降解DEP。菌株Sphingobium sp.SHJ对DEP降解过程符合一级动力学方程。在好氧条件下,SHJ对DEP的降解速率常数k为0.8139 h^-1,降解半衰期为0.85 h;在模拟浅层含水层氧气受限（限氧）环境条件下,SHJ对DEP的降解速率常数k为0.1534 h^-1,降解半衰期为4.52 h。（2）Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP的生物降解途径与机理在Sphingobium yanoikuyae SHJ降解DEP过程中,用高效液相色谱串联高分辨率质谱分析法（HPLC-HRMS）技术捕获分析中间降解产物,共鉴定出四个中间降解产物,包括邻苯二甲酸二乙基甲酯（EMP）、邻苯二甲酸单乙酯（MEP）、邻苯二甲酸单甲酯（MMP）和邻苯二甲酸（PA）。根据DEP和这些中间降解产物随时间的变化推测出两条DEP代谢途径:第一条是通过DEP的顺序性水解反应产生DEP→MEP→PA;另一条是当体系中存在少量甲醇时通过DEP的脱甲基作用或酯交换反应以及水解过程发生DEP→EMP→MEP→MMP→PA的降解途径。在模拟浅层含水层氧气受限（限氧）条件下,EMP、MEP和MMP可以依次降解,但PA不能被进一步地降解。而在最佳好氧条件下,DEP及其四个中间降解产物都可以快速的降解。因此建议在浅层含水层环境中用Sphingobium yanoikuyae SHJ彻底降解DEP需要加氧。（3）Sphingobium yanoikuyae SHJ的全基因组学分析结合利用第二代高通量测序平台Illumina Miseq测序和基于PacBio RS Ⅱ测序平台的第三代单分子测序技术对Sphingobium yanoikuyae SHJ进行全基因组测序,并对基因组序列进行基因预测和功能注释,试图找出对邻苯二甲酸酯类的降解酶相关基因。全基因组测序得到的片段个数为438,236个,片段的总长度为1,800,913,400。全基因组序列是一条总长度为5,669,383bp、GC含量为64.23%的完整序列,包括一个长度为5,258,921bp、GC含量为64.36%的环状染色体（Chr）和两个长度分别为189,186bp和220,039bp,GC含量分别为61.43%和63.68%的两个质粒（pSES220和pSES189）。通过对菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ基因预测和功能注释,获知该全基因序列有5,402个基因,其中包括5,183个蛋白编码基因,543个假基因,76个核糖核酸RNA基因（12个核糖体核糖核酸rRNA基因和61个转移核糖核酸tRNA）,以及3个非编码核糖核酸RNA基因。由基因注释,得到5,033个开放阅读框,对其蛋白编码基因进行功能解析,发现有44个基因编码了可能参与PAEs发生酯基水解为单酯和PA的代谢酶类,且有13个基因编码的水解酶和酯酶与数据库中PAEs代谢酶具有同源氨基酸序列。其中在一个小质粒pSES189上有一个6.9 kb大小、共包含7个开放阅读框的区域（phtRCBAaDAcAd,由操纵子phtR、phtC、phtB、phtAa、phtD、phtAc和phtAd依次编码了MarR转录调节蛋白、4,5-双羟基邻苯二甲酸脱羧酶、4,5-双羟基邻苯二甲酸脱氢酶、4,5-双加氧酶氧化酶、烟酸核苷酸焦磷酸化酶、铁氧化还原蛋白和铁氧化还原蛋白还原酶）被推测作用于PA转化为原儿茶酸过程,且该基因簇中的基因组成与已报导的PA降解菌Arthrobacter keyseri 12B质粒中编码其降解酶的基因簇pht（phtBAaAbAcAdCR）高度相似。以上菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ全基因组研究结果为进一步研究代谢过程中的关键酶奠定了基础。（4）Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP生物降解酶系的蛋白质组学分析利用差异蛋白质组学分析了菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ在分别以DEP和葡萄糖为唯一碳源的条件下、在不同的培养时间（DEP降解初期第24 h,降解后期第96 h）所产生的胞外酶及胞内酶中的蛋白表达的差异,并推测了与DEP生物降解相关的重要酶类及其在代谢DEP过程中的响应。这些酶蛋白在DEP存在环境下的表达变化相比葡萄糖明显更丰富。使用差异表达蛋白的校正p-value（p<0.05,fold>1.2）,从所有对比组中确定了727个具有功能预测的蛋白质,统计了各个对比组间鉴定到的超过2倍上调和低于0.5倍下调的所有差异表达蛋白的统计数。与葡萄糖为碳源相比,Sphingobium yanoikuyae SHJ以DEP为碳源在降解初期所产生的胞外酶差异蛋白总数为58个（其中上调蛋白41个,主要涉及胞外水解酶、甲基转移酶和碳碳裂解酶）,胞内酶差异蛋白总数为119个（其中上调蛋白26个,主要涉及胞内水解酶）;在降解后期所产生的胞外酶差异蛋白总数为71个（其中上调蛋白43个,主要涉及胞外水解酶、甲基转移酶、转移酶、碳水化合物催化酶、碳碳裂解酶）,胞内酶差异蛋白总数为162个（其中上调蛋白89个,主要涉及胞内水解酶、甲基转移酶、转移酶和碳水化合物催化酶）。以不同的培养时间做对比,Sphingobium yanoikuyae SHJ在DEP降解后期与初期相比所产生的胞外差异蛋白总数为119个（其中上调蛋白64个,主要涉及胞外水解酶、甲基转移酶、转移酶、碳水化合物催化酶、碳碳裂解酶）,胞内酶差异蛋白总数为222个（其中上调蛋白125个,主要涉及胞内水解酶、转移酶、碳水化合物催化酶）。另外,一些膜蛋白、脂蛋白和菌毛蛋白在DEP降解初期表达上调明显,而转运蛋白、伴侣蛋白和细胞分裂蛋白在DEP降解后期显著上调。通过生物信息学分析相关蛋白功能,发现与DEP降解相关酶类被明显地诱导或表达显著上调,推测这些差异表达蛋白参与在Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP的代谢途径中。该研究揭示了菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ暴露于不同的营养环境下所发生的蛋白质组学和代谢变化。（5）Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP生物降解关键酶的分离纯化及鉴定在DEP降解酶活测定及其酶学性质等研究基础上建立酶分离纯化体系,实现Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP降解粗酶液混合物的分离与纯化,最终纯化出四个纯化酶条带（条带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）,并对其进行蛋白鉴定及功能预测等研究。其中,条带Ⅰ的最终纯化倍数为1.21,表观分子量为58.50 kD,其具有转移酶活性、双加氧酶活性和转运蛋白功能;条带Ⅱ的最终纯化倍数为1.21,表观分子量为35.75kD,其具有异构酶活性、水解酶活性及转移酶活性;条带Ⅲ的最终纯化倍数为1.19,表观分子量为68.94 kD,是一个碳-碳裂解酶,能催化C-C键的断裂;条带Ⅳ的最终纯化倍数为1.19,表观分子量为62.76 kD,其具有转移酶活性。结合前期研究所得的DEP微生物降解途径、降解菌全基因组学、降解酶系蛋白质组学的研究结果。推测条带Ⅰ和条带Ⅳ的转移酶参与甲基转移以及酯基的交换从而在DEP降解发生DEP→EMP→MEP→MMP→PA转化路径中发挥重要作用。条带Ⅰ中的双加氧酶的环开裂催化作用在模拟浅层含水层氧气受限（限氧）条件下对DEP的生物降解过程并未发挥作用,推测其主要参与PA在好氧条件下的进一步降解。同时具有异构酶活性、水解酶活性及转移酶活性的条带Ⅱ蛋白酶,推测其在DEP代谢过程中发挥关键作用,有可能同时参与DEP的顺序性水解反应产生DEP→MEP→PA以及通过DEP的脱甲基作用或酯交换反应以及水解过程发生DEP→EMP→MEP→MMP→PA这两条路径的代谢过程。而条带Ⅲ的碳-碳裂解酶,区别于水解反应,推测该酶催化DEP脱甲基作用的发生。这四个纯化蛋白酶及其预测功能说明菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ在模拟浅层含水层氧气受限环境条件下对DEP的降解途径中,确实存在DEP的水解反应、脱甲基作用和酯基转移过程,三者均可作为DEP的微生物降解机制。同时这些纯降解酶的编码基因序列也在菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ全基因组序列中,说明其降解功能是由菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ的基因编码并表达的,这将会对后期构建更为行之有效的微生物降解工程菌株的尝试奠定基础。本课题研究的特色与创新之处在于:（1）发现一条邻苯二甲酸二乙酯（DEP）在模拟浅层含水层环境中生物降解的新途径;（2）在菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ小质粒中发现一个邻苯二甲酸降解基因簇（phtRCBAaDAcAd）;（3）结合全基因组序列、差异蛋白质组学和降解关键酶的分离纯化与鉴定的方法揭示Sphingobium yanoikuyae SHJ中DEP降解关键酶的作用机制及基因编码序列。本课题从DEP微生物降解途径、降解菌全基因组学、降解酶系蛋白质组学来阐释菌株Sphingobium yanoikuyae SHJ对DEP的生物降解过程,这三个方面的研究密切关联、相互印证,能更好地揭示浅层含水层环境中DEP的生物降解机理,并对后期构建更为行之有效的微生物降解工程菌株或质粒的尝试将具有十分重要的应用价值和创新性,同时促进利用生物修复技术治理PAEs污染环境的进程。