围生期窒息所致的缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生儿期危害最大的常见病之一，常引起新生儿死亡和其后神经系统的发育障碍。国外研究已证实，激活素A(activin A，ACT A)离体情况下具有神经保护作用；本项目组前期研究表明，外源性ACT A对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)具有保护作用，可抑制HIBD后脑组织水肿及脑细胞凋亡，从而减轻脑损伤的程度。但内源性ACT A的表达与HIBD的相关性尚未见报道。本研究采用动物实验与临床研究相结合的方法，探讨内源性ACT A在HIBD大鼠脑组织及窒息新生儿血液中的表达规律及其意义，旨在为进一步研究新生儿HIE的发病机制及防治措施提供实验依据。一、基础研究1．材料与方法1．1实验动物及材料新生7日龄Wistar大鼠100只，平均体重(15.6±3.2)g，雌雄不拘(山东大学实验动物中心)；ACT A单克隆抗体(美国R&D System公司)；过氧化酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidas，SP)免疫组化检测试剂盒(英国Lab Vision Corporation)。1．1实验方法实验动物随机分为3组：正常对照组(n=10)、假手术组(n=10)和HIBD模型组(n=80)。HIBD模型组按Rice方法，采用左侧颈总动脉结扎后置入含8％氧气的氮气仓中缺氧2h，建立HIBD标准模型，根据造模后不同时间点分为8组(1h、3h、7h、10h、12h、24h、48h、72h)。每组10只动物。于特定的时间点将实验鼠脑组织浸入4％多聚甲醛磷酸盐(phosphate buffered saline，PBS)缓冲液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石腊包埋，冠状连续切片，常规苏木素-伊红染色(hematoxyl in and eosin，H&E)，光镜下观察组织病理学变化，免疫组织化学方法检测ACT A。1．3统计学方法所有数据采用((?)±s)表示，两组间比较采用t检验及秩和检验；多组间比较采用单因素方差分析及q检验。非齐性资料采用近似法t检验。P值显著性标准为0.05。所有统计分析采用SAS6.0软件包完成。2．结果正常对照组、假手术组均于10h时间点处死(因预实验显示，ACT A表达峰值出现在模型组造模后10h)。光镜下观察脑组织切片，两侧未见或偶见ACT A弱阳性细胞。经方差分析，组间(同侧)及组内(两侧)差异均无显著性(P＞0.05)。模型组各时间点右侧大脑半球偶见ACT A弱阳性细胞，与对照组同侧比较无显著性差异(P＞0.05)。模型组1h，左侧扣带皮质可见少量ACT A阳性细胞，与右侧比较，有显著性差异(P＜0.05)。以后各时间点阳性细胞逐渐增多，免疫染色逐渐加深。ACT A表达峰值出现在模型组10h时间点，左侧额顶皮质、扣带皮质、纹状体、齿状回可见大量ACT A强阳性细胞广泛表达，与对侧及正常对照组、假手术组同侧比较均有显著性差异(P＜0.01)。模型组12h时间点，左侧ACT A阳性细胞数量开始减少且着色减弱，但海马区始出现阳性细胞；至72h时间点，左侧额顶皮质及海马区仍可见ACT A弱阳性细胞，与右侧比较差异有显著性(P＜0.05)。模型组各时间点ACT A阳性细胞表达组间比较，左侧有显著性差异(P＜0.01)，右侧无显著性差异。阳性反应主要集中于细胞浆及轴、树突，核不染色。二、临床研究1．资料和方法1．1对象1．1．1窒息组选择2004～2006年济南市中心医院产科自然分娩的足月窒息新生儿做为观察对象，共纳入58例。结合1996年杭州会议修订的HIE诊断依据及采用病史、临床表现、检验综合指标进行评分分度，分为3组：轻度组23例，全部治愈出院；中度组26例，死亡1例；重度组9例，死亡2例。1．1．2正常对照组共30例，为2004～2006年在济南市中心医院产科自然分娩的正常足月新生儿。两组新生儿的出生体重、胎龄、日龄、性别无显著性差异。1．2实验方法两组新生儿均于生后即刻采集脐血3ml(国内外资料表明，74.9％～98.2％的胎儿宫内窘迫发生在妊娠期或分娩时，HIBD在宫内缺氧时已经开始发生)，并于生后7～10天(HIE恢复期)自股静脉穿刺采血3ml。分离血清，采用酶联免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)测定血清ACT A、FGF及TNF-α。1．3统计学分析所有数据采用((?)±s)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用q检验。P值显著性标准为0.05。所有统计分析采用SAS6.0软件包完成。2．结果窒息新生儿脐血ACT A、FGF和TNF-α即开始升高，与对照组比较，有显著性差异(3.64±0.69 ng／ml vs 2.95±0.34 ng／ml，P＜0.001；77.55±23.18pg／ml vs 36.43±9.51 pg／ml，P＜0.001；10.72±1.50 ng／ml vs 9.15±0.99ng／ml，P＜0.001)。恢复期，ACT A血清含量继续升高，FGF有所下降，但仍维持在较高水平，两者与对照组比较差异有显著性(5.59±1.33 ng／ml vs 2.93±0.25 ng／ml，P＜0.001；64.21±18.70 pg／ml vs 41.69±9.08 pg／ml，P＜0.001)；TNF-α血清含量降低明显，已基本接近正常水平，与对照组比较差异无显著性(9.41±0.87 ng／ml vs 9.03±1.06 ng／ml，P＞0.05)。三、结论本研究结果表明，HIBD可诱导内源性ACT A在脑组织及血液中的表达增加，且与病情程度呈正相关，即病情越重，内源性ACT A水平升高越显著。推测可能由于HIBD反馈性刺激ACT A这一神经保护性细胞因子的升高，以利于HIBD后神经元的存活及脑组织的修复有关。本研究阐明了内源性ACT A在HIBD大鼠脑组织及窒息新生儿血液中的表达规律及其意义，提示ACT A在窒息新生儿HIE的病理过程中可能发挥重要作用。其表达产物可作为新生脑细胞缺氧缺血的敏感指标，亦可作为研究HIE后细胞代谢改变的一项新指标和测定药物对脑缺氧缺血干预治疗作用的一种新方法，从而最终为临床防治新生儿HIE提供了一条新的思路，对降低新生儿HIE的致死率及致残率具有潜在意义。