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研究目的:该研究包括以下两个目的:1,以常用的减毒鼠伤寒沙门氏菌作为载体,构建携带Hp的中性粒细胞活化蛋白(HP-NAP)基因的疫苗株;并免疫小鼠,研究表达HP-NAP的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫保护效果.2,构建携带大肠杆菌血溶素(hlyE)基因的减毒鼠伤寒沙门菌,并将hlyE与Hp的ureB融合表达构建疫苗株,免疫小鼠,研究hlyE对重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株免疫保护效果的增强作用.材料和方法:1.携带目的基因的原核表达质粒构建;Hp悉尼株(SS1)用改良Skirrow培养基,37℃微需氧培养;大肠杆菌K-12株用LB培养基,37℃过夜培养;分别收集细菌的基因组DNA.以Hp基因组DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增HP-NAP基因.2.测序和同源性分析;挑选阳性克隆,提取质粒,以pTrc99A的通用引物分别对HP-NAP、ureB/hlyE基因进行序列测定;测序的核苷酸结果及根据核苷酸序列推测的氨基酸序列分别与GenBank中相关基因的核苷酸与氨基酸序列进行BLAST分析,比较它们的同源性.3.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的构建;插入NAP基因和ureB/hlyE融合基因的重组质粒,分别转化减毒鼠伤寒沙门菌过渡菌LB5000,抽提修饰后的重组质粒再转化减毒鼠伤寒沙门菌载体菌SL3261,挑选amp抗性的阳性菌落培养后,抽提质粒行酶切和PCR鉴定,获取阳性重组菌落分别命名为减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株SL3261(pTrc99A-NAP)和SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE).4.目的蛋白在重组减毒鼠伤寒沙门氏菌中的表达和免疫原性分析;携带目的基因的重组SL3261菌和对照菌SL3261、SL3261(pTrc99A),37℃过夜培养后,转接到5ml培养基中诱导培养,5小时后收集处理细菌,进行SDS-PAGE电泳.电泳结果进行薄层扫描分析,分析所表达的目的蛋白在减毒鼠伤寒沙门菌中的表达水平和含量.5.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株免疫鼠;雌性8周龄的Balb/c小鼠随机分为空白对照组、SL3261组、SL3261(pTrc99A)组、SL3261(pTrc99A -NAP)组、SL3261(pTrc99A-ureB)组和SL3261(pTrc99A-ureB/hlyE)组;空白组灌喂生理盐水,其他各组分别灌喂空SL3261菌,携带空质粒pTrc99A、pTrc99A-NAP、pTrc99A-ureB、pTrc99A-ureB/hlyE的重组减毒鼠伤寒沙门菌,剂量为10<7>CFU/只,一周一次,免疫三次.最后一次免疫后四周,各组均予Hp SS1菌株(10<7>CFU/只)攻击,攻击二次,隔日一次.6.重组减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株诱导的免疫保护效果; Hp攻击4周后,颈椎脱臼法处死小鼠,去除前胃,把腺胃组织分为两份,一份组织称重匀浆后涂布改良Skirrow培养基平板,37℃微需氧培养3天,计数Hp菌落数;一份组织中性福尔马林固定,石蜡包埋后,切片行改良Giemsa染色和常规HE染色,显微镜下观察胃组织Hp定植密度和胃组织病理学,并进行评分.7.统计分析;胃组织Hp定植密度评分、Hp定量培养结果和胃黏膜炎症评分用Mann-WhitneyU test进行检验.P<0.05为统计学有差异.所有检验均用SPSS 10.0 for windows软件包进行.结 论:1,利用基因工程的方法构建了以减毒鼠伤寒沙门菌为载体表达HP-NAP、UreB/hlyEHp疫苗株.2,免疫印迹实验证实重组疫苗株均有良好的免疫原性.3,表达HP-NAP、UreB/hlyE的重组疫苗株对实验小鼠有不同程度的免疫保护作用,可以明显降低小鼠胃内Hp的定植水平.4,表达融合蛋白ureB/hlyE的减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫保护效果高于只表达ure的疫苗株.hlyE能一定程度地增强减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株的免疫效果,可以作为提高此类疫苗免疫效果的一种途径.