目的TIPE2（Tumor necrosis factor-alpha-induced protein-8like-2,TNFAIP8L2）是由美国宾夕法尼亚大学Youhai H. chen教授在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中首先发现的新基因，其与肿瘤坏死因子诱导蛋白-8（tumor necrosis factor-α-induced protein-8，TNFAIP8）高度同源，负性调节特异性免疫和固有免疫，是体内调节免疫动态平衡的重要基因之一。敲除TIPE2基因的鼠(TIPE2-/-)可表现为多器官的炎症，脾脏肿大和过早的死亡。TIPE2包含一个类似死亡效应结构域(death effect domain，DED)样蛋白区域，可与caspase-8蛋白结合，从而影响TNFα介导的凋亡，在肿瘤的发生中发挥重要作用。先前研究表明TIPE2不仅高表达于免疫细胞和免疫组织，如淋巴结、淋巴细胞和单核细胞等，也表达于其他非免疫细胞，如，腺上皮细胞、分层或假复层上皮细胞及肝细胞、神经元细胞、软骨细胞。而且对人TIPE2特性的研究表明TIPE2可能参与了很多疾病的发生发展，但具体机制尚不清楚。最近Luan等应用蛋白印迹法（Westernblot）和RT-PCR检测发现，从BALB/C小鼠脾脏分离提取的CD4+CD25+Treg细胞（简称Treg细胞）中可检测到TIPE2表达，并可增强Treg细胞免疫抑制功能，提示TIPE2基因可能与Treg细胞介导的免疫调控有关，具体机制尚不清楚。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，在感染、肿瘤和移植中发挥重要作用。据报道，Treg细胞可分泌免疫抑制因子从而直接抑制效应性T细胞功能。在很多肿瘤疾病中，Treg细胞的广泛浸润提示预后差、生存率低。研究发现Treg细胞缺失或功能抑制可有效提高机体肿瘤免疫。人FOXP3基因是转录因子forkhead/winged-helix家族成员之一，已被广泛认可是Treg细胞的特异性标记物，是调控Treg细胞发育、分化及成熟的关键转录因子。FOXP3不仅表达于T细胞系，很多肿瘤细胞也均组成性表达（黑色素瘤、神经胶质瘤等）FOXP3，提示FOXP3赋予肿瘤细胞免疫逃逸机能。鉴于免疫系统内TIPE2基因的正常表达可以有效的防止机体过度反应和维持免疫稳态，我们推测TIPE2基因和FOXP3在PLC发病机制中具有某种关系。原发性肝癌(Primary Liver Cancer, PLC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，发病隐匿，进展迅速，预后差，死亡率位居第三，近年来其发病率呈上升趋势，严重危害人类健康，攻克癌症已成为世界性的难题。肿瘤的发生是细胞的恶性增殖与细胞凋亡之间平衡失调的结果，同时机体炎症免疫微环境在肿瘤形成和发展中具有重要调控作用，而机体免疫功能低下及免疫监视功能降低是肿瘤形成和发展的关键。因此，本课题的主要目的是通过检测TIPE2及FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs及肝癌组织中的表达情况，一方面了解PLC患者PBMCs及肝癌组织中TIPE2表达情况，另一方面探讨TIPE2和FOXP3在PLC发病机制及进展中的作用，为进一步阐明TIPE2在PLC发生和发展中的调控作用奠定基础。方法1病例收集：参照2009年最新《原发性肝癌规范化诊治专家共识》，选择2010-3/2012-2河北医科大学第三医院中西医结合肝病科40例PLC患者和肝胆外科20例PLC肝移植术患者，共60例，同时排除应用免疫药物治疗的患者。男43例，女17例，年龄54.83±13.58岁，均合并肝硬化，其中HBV感染者30例，HCV感染者8例，酒精性肝病5例,不明原因者17例。同期选择健康对照组30人，男13例，女17例，年龄39.23±11.53岁。40例PLC患者及健康对照者均清晨空腹抽取抗凝静脉血6ml，其中3ml用于分离PBMCs，3ml用于流式技术检测；抽取不抗凝静脉血5ml，分离血清备用。收集20例住院PLC患者肝移植术后新鲜的组织标本，分别留取肝癌组织及距癌组织3-5cm的癌旁组织各20份，高分化8例，中分化7例，低分化5例。取部分肝癌组织应用RT-PCR法检测TIPE2和FOXP3mRNA的表达，其余置于-80℃备用。2PLC患者PBMCs中TIPE2和FOXP3基因表达的检测：分别收集40例PLC患者及健康对照者新鲜外周肝素抗凝血3ml，Ficoll密度梯度离心法分离PBMCs，应用Trizol一步法提取PBMCs中的总RNA，应用半定量RT-PCR检测，了解TIPE2mRNA和FOXP3mRNA的表达情况，并比较各组的差异。3PLC患者肝组织中TIPE2和FOXP3基因表达的检测：收集20例PLC患者肝移植术后的肝癌组织和癌旁组织标本各20份，Trizol一步法抽提肝组织总RNA，半定量RT-PCR法分别检测肝组织TIPE2mRNA和FOXP3mRNA表达情况，并比较各组的差异。4外周血T淋巴细胞亚群检测：收集40例PLC患者及健康对照者抗凝的静脉全血3ml，应用流式细胞技术检测外周血T细胞亚群的表达5TIPE2mRNA与PLC患者临床参数以及FOXP3的相关性分析利用SPSS13.0软件对PLC患者PBMCs及肝癌组织中TIPE2的mRNA与FOXP3的mRNA水平进行相关性检验，了解两者之间的相关关系。并对PLC患者TIPE2的mRNA水平与PLC临床参数—血清AFP水平、AST/ALT、T淋巴细胞亚群及肿瘤组织分化程度的相关性进行分析。结果1PLC患者和健康对照者临床资料及实验室各指标的汇总分析见Table1。2TIPE2mRNA在PLC患者PBMCs及肝组织中的表达结果显示，PLC患者PBMCs中TIPE2mRNA阳性检测率（75%）明显低于健康对照组PBMCs中TIPE2mRNA的阳性检测率（100%），两组有显著统计学差异（P=0.003）；RT-PCR半定量分析结果显示：PLC患者PBMCs中TIPE2mRNA水平较健康对照组明显降低[0.33(0.39) vs1.16(0.45)]，二组比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝癌组织及癌旁组织TIPE2mRNA阳性检测率均为75%，两组无统计学差异（P>0.05）。RT-PCR半定量分析结果显示PLC患者肝癌组织中TIPE2水平较癌旁组织下降（0.25±0.19vs0.26±0.20），但结果无统计学差异（P>0.05）。3FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs及肝组织中的表达结果显示，PLC患者PBMCs中FOXP3mRNA阳性检出率（92.5%）明显高于健康对照者PBMCs中FOXP3mRNA的检测率46.67%，两组阳性率有显著差异（P<0.001）。RT-PCR半定量分析结果显示：PLC患者PBMCs中FOXP3水平较健康对照组明显升高[5.17(3.13) vs1.10(2.92)]，二者比较差异有统计学意义(P<0.001)。肝癌组织及癌旁组织FOXP3mRNA阳性检出率均为85%，结果无统计学差异（P>0.05）。RT-PCR半定量分析结果显示PLC患者肝癌组织中FOXP3水平较癌旁组织显著升高（3.72±2.03vs2.54±1.58），二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。4TIPE2mRNA与PLC临床参数的相关性分析根据血清AFP、AST/ALT水平，将PLC患者分为AFP低水平组(AFP≤400ng/ml)和高水平组(AFP>400ng/ml)， AST/ALT低水平组（AST/ALT≤1.0）、中水平组（1<AST/ALT<2）和高水平组（AST/ALT≥2）。采用非参数秩和检验进行各组间TIPE2水平差异性比较，结果显示，AFP和AST/ALT低水平组TIPE2的mRNA表达明显高于AFP和AST/ALT高水平组，所有数据均以中位数（四分位间距）[M(QR)]表示：0.41(0.33) vs0.14(0.13)、0.68(0.09) vs0.42(0.17) vs0.08(0.15)，P<0.01；相关性分析发现TIPE2与AFP水平及AST/ALT比值均呈负相关（AFP，r=-0.950，P<0.001；AST/ALT，r=-0.982，P<0.001）。根据Edmondson-Steiner分级法：本次试验组织病理结果示，Ⅰ级：高分化8例；Ⅱ级：中分化7例；Ⅲ级：分化较差5例。结果显示，高分化组TIPE2mRNA表达显著高于低分化组：0.42±0.11vs0.28±0.13，P<0.05，Ⅲ级未见表达。5PLC患者外周血T细胞亚群表达结果显示，PLC患者外周血CD3+、CD4+T细胞数量及CD4/CD8比值显著降低，而CD8+T细胞增加，与对照组比较差异有统计学意义（CD3+，64.63±7.13vs70.97士3.80，P<0.001；CD4+，31.61±4.96vs44.66士3.62，P<0.001；CD8+，31.56±5.27vs25.63士4.03，P<0.001；CD4/CD8，1.05±0.33vs1.78士0.34，P<0.001）。6PLC患者PBMCs中TIPE2及FOXP3与T细胞亚群的相关性分析Pearson相关性分析显示，TIPE2mRNA水平与CD3+、CD4+、CD4/CD8均呈正相关，相关系数分别为：r=0.658， P<0.001；r=0.580，P<0.01和r=0.655，P=0.001，但与CD8+T细胞呈负相关（r=-0.635，P=0.001）。相反，FOXP3mRNA水平与CD3+、CD4+、CD4/CD8均呈负相关，相关系数分别为：r=-0.598， P=0.002；r=-0.487，P=0.016和r=-0.530，P=0.008，但与CD8+T细胞呈正相关（r=0.478，P=0.018）。7TIPE2mRNA与FOXP3mRAN的相关性分析Pearson相关性分析显示，PLC患者PBMC中TIPE2和FOXP3mRNA水平呈负相关，r=-0.848（P<0.001）；肝癌组织中TIPE2和FOXP3mRNA表达呈负相关，r=-0.681（P=0.001）；癌旁组织中TIPE2和FOXP3mRNA表达呈负相关，r=-0.705（P=0.001）。结论1PLC患者PBMC及组织中低表达或部分缺少表达TIPE2mRNA2TIPE2mRNA在PLC患者PBMCs中的表达较健康人显著降低（P<0.05）；TIPE2mRNA在癌组织的表达较癌旁组织降低，但无统计学差异（P>0.05），可能与患者例数较少有关3FOXP3mRNA在PLC患者PBMCs中的表达较健康人显著升高，在癌组织中的表达较癌旁组织显著升高4TIPE2基因可能通过负性调控免疫细胞活性及细胞凋亡，从而参与PLC的发病进程。