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肝癌是常见消化系统肿瘤之一,其作为全球高发的第三大肿瘤发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。目前肝癌的治疗方法主要包括手术治疗、放射治疗、药物治疗和基因治疗,其中肝癌的药物治疗是主要治疗手段。目前临床上使用的传统的抗肝癌药物最大的缺点是缺乏组织选择性,在体内分布广泛,使其在发挥药效的同时往往产生严重的全身性毒副作用。因此,寻找低毒高效的靶向药物已成为抗肝癌药物研发的重点问题。研究发现PI3K/Akt/mTOR信号通路在肝癌中是高度活化的,其通过促进血管新生、细胞增殖以及蛋白质翻译促进肝癌的发生和发展。同时该信号通路中AKT的反馈激活与肝癌化疗耐药也有着密切的联系。因此,寻找靶向PI3K/Akt/mTOR信号通路并抑制AKT反馈激活的小分子化合物有望解决目前该信号通路的靶向药物存在的药效降低的问题。本课题前期发现结构全新的吲哚酰肼类化合物IHZ-1对肝癌细胞HepG2具有显著的杀伤作用(IC50=3.54±0.38μM),而对正常的人胚肺成纤维细胞MRC-5杀伤作用不明显(IC50>100μM),同时体内研究数据也发现IHZ-1对肝癌异种移植瘤模型小鼠的抑瘤率高达72.6%,且对小鼠的体重无影响,提示IHZ-1具有良好的抗肝癌活性、药物选择性以及安全性。为了进一步研究IHZ-1的抗肝癌机理,我们选择了HepG2和Huh-7两株肝癌细胞展开深入研究。首先通过MTT再次验证了IHZ-1对HepG2和Huh-7细胞均具有显著的杀伤作用,IC50分别为5.08±0.14μM和6.59±0.32μM。通过观察细胞形态也发现IHZ-1处理的肝癌细胞体积变小,变亮变圆,与其他细胞出现相互分离的现象,进一步说明IHZ-1诱导了肝癌细胞的死亡。前期研究发现IHZ-1能够引起HepG2细胞周期阻滞并诱导细胞凋亡。因此,我们在Huh-7细胞中进行了同样的研究。结果显示,IHZ-1处理的Huh-7细胞发生了G2/M期阻滞,且随着药物浓度的增加,其凋亡比例呈现逐渐上升的趋势,分别为5.6%、32.8%、42.2%,提示IHZ-1通过诱导细胞周期阻滞和凋亡进而杀死肝癌细胞。我们前期研究结果显示PI3K/Akt/mTOR信号通路在肝癌患者的组织样本中高度活化。因此,我们采用Western Blot实验检测IHZ-1对肝癌细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。结果显示,IHZ-1显著抑制了p-PDK1(Ser241)、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p-mTOR(Ser2448)、Raptor(mTORC1)、Rictor(mTORC2)的表达。同时CO-IP显示p-P70S6K(Thr389)与Raptor相互作用受到抑制,mTORC1的下游蛋白翻译的调控也受到了抑制,提示IHZ-1抑制了PI3K/Akt/mTOR信号通路,且其可能是一个mTORC1的抑制剂。值得注意的是IHZ-1并没有像传统的mTORC1抑制剂引起AKT的反馈性激活。为了研究这一问题,我们对AKT反馈激活信号通路中的关键蛋白IRS-1的磷酸化水平进行检测,结果显示,IHZ-1激活了IRS-1的磷酸化,但其上游的pP70S6K的表达却是下调的。因此我们采用DCFH-DA探针和Western Blot分别检测IHZ-1对调控IRS-1的另一通路ROS/JNK的影响。结果显示,IHZ-1处理的肝癌细胞ROS大量累积,JNK的磷酸化也被激活。进一步采用ROS抑制剂NAC和JNK抑制剂SP600125分别与IHZ-1联合处理HepG2和Huh-7后,与IHZ-1单独处理组相比,共处理组的细胞的凋亡比例呈现下降趋势,提示IHZ-1诱导的肝癌细胞的凋亡是通过激活ROS/JNK信号通路实现的。综上所述,IHZ-1能够抑制多种肿瘤细胞的周期进程并诱导肿瘤细胞凋亡,其作用机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路以及激活ROS/JNK途径来实现的。