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利用生物催化法制备光学活性化合物已经成为当今的研究热点之一。微生物羰基还原酶催化前手性羰基还原合成手性醇,已成为手性药物及其中间体的重要合成途径。本文对利用微生物羰基还原酶催化法不对称还原4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(2)合成抗Ⅱ型糖尿病药物磷酸西他列汀关键手性中间体(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-,三氟苯基)丁-1-酮((S)-1)进行了研究,实现了(S)-1高效、高对映选择性的制备。采用分级筛选模型,从125份土壤样品中分离出能够以苯乙酮为唯一碳源生长的89个菌株。其中24个菌株能够将前手性酮2还原为1。编号为40-1的菌株表现出最高的羰基还原酶活性和对映选择性,被选为后续研究的目标菌株。该菌株经16S rDNA序列比对分析,将其鉴定为Pseudomonas pseudoalcaligenes,命名为类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)XW-40。利用响应面与单因素法对类产碱假单胞菌XW-40产羰基还原酶的发酵条件进行优化。得出最佳培养基组成及培养条件为:D-果糖13 g/L,牛肉膏11.2 g/L,蛋白胨28 g/L,NaCl 4.6 g/L,MgSO4?7H2O 1.2 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,pH为7.0,培养温度为30℃,摇床转速为180 r/min,培养时间为36 h。在优化的条件下,类产碱假单胞菌XW-40菌株所产的羰基还原酶活力达326 U/g(干重细胞),较优化前提高了23%。通过对该菌株还原2制备(S)-1工艺的优化,确定最佳的底物浓度为10 g/L,细胞浓度为80 g(干重)/L,辅底物为5%(w/v)葡萄糖,助溶剂为10%(v/v)DMSO;最佳pH为7.0,温度为30℃,摇床转速为180 r/min,反应时间为24 h。在最佳条件下反应,产率>99%,ee值>99%。进一步对细胞的重复利用进行研究,结果发现5个批次后的收率仍为47%,即在1L的反应体系中使用同一批次的细胞,可以生成的产物量高达37.4 g。为了提高底物的初始浓度与减少反应中底(产)物对羰基还原酶的抑制作用,采用树脂原位吸附技术,将底物先吸附于大孔树脂XAD-7上再加入反应体系进行转化。使用此树脂原位吸附策略,使得底物初始浓度由10 g/L提高至25 g/L,反应45 h后,产率为90.5%,ee值>99%。为提高生物催化剂的稳定性,对类产碱假单胞菌XW-40细胞的海藻酸钠包埋固定化工艺进行了初步研究。得到最佳的固定化条件为:海藻酸钠浓度为1.5%(w/v),CaCl2的浓度为3%(w/v),细胞的包埋浓度为16%(w/v),固定化时间为6 h。采用在此最佳条件制得的固定化细胞进行还原2合成(S)-1的反应,底物的浓度为10 g/L,细胞终浓度80 g/L,反应时间35 h,产率为98.8%,ee值>99%。