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细胞凋亡是鱼类发育过程中的一种生理性保护机制,在鱼类生长发育过程中具有重要作用。本研究采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术首次扩增出草鱼凋亡相关基因Caspase9与BCL-2的cDNA全长,对其分子生物学特征进行分析,实时荧光定量PCR检测了镉胁迫后草鱼肝胰腺中两种基因的表达变化。对该基因进行原核表达,重组蛋白纯化和质谱鉴定,并研究了镉胁迫对草鱼肝胰腺抗氧化酶系统和显微结构的影响。草鱼Caspase9 cDNA全长为1716 bp。其中ORF为1308 bp,编码435个氨基酸,5’非编码区为225 bp,3’非编码区为183 bp。预测蛋白相对分子量为48.24kDa,pH等于8时等电点为6.44。Caspase9蛋白无信号肽和跨膜结构域,N端含有典型的Caspase募集结构域(caspase recruitment domain CARD),Caspase家族P20(P174-E304)大亚基结构域和P10(A347-S434)小亚基结构域也存在于Caspase9蛋白中。草鱼Caspase9组氨酸活性位点H237SAYDCCVVIILSHG251和半胱氨酸活性位点K291PKLFFIQACGG302都位于P20大亚基结构域中。系统进化树显示草鱼Caspase9与稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)Caspase9的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,镉胁迫能够诱导草鱼Caspase9基因在鱼体肝胰腺中的表达,随着镉处理浓度升高和暴露时间延长其表达量显著上调(P<0.05)。根据草鱼Caspase9 cDNA序列构建pET28a-Caspase9原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)DE3中,SDS-PAGE电泳检测显示,IPTG能够诱导pET28a-Caspase9载体表达,重组蛋白分子量大小为50 kDa左右,与预测一致。利用Ni-NTA His?Bind Resin树脂成功纯化到重组蛋白,质谱测定重组蛋白的相对分子质量为48.95kDa,pH等于8时等电点为6.17,与预测的结果基本一致,重组蛋白表达正确。草鱼BCL-2基因的cDNA全长为1436 bp。其中ORF为687 bp,编码228个氨基酸,5’非编码区为236 bp,3’非编码区为513 bp。预测蛋白相对分子量26.19kDa,pH等于8时等电点为5.09。草鱼蛋白无信号肽,在C末端有疏水性跨膜结构域(S204-A226),N端含有典型的同源结构域BH4(N9-W28),同时也包含BCL_like同源结构域BH1、BH2和BH3(L69-A191)。系统进化树显示该基因与稀有鮈鲫BCL-2的亲缘关系最近。鱼体肝胰腺中的BCL-2基因表达受镉胁迫的影响,在浓度为0.5mg/L的镉溶液中胁迫7d后其表达量显著上调(P<0.05),其它处理组的表达量均受到不同程度的抑制(P<0.05)。根据cDNA序列,去掉跨膜结构域序列,构建pET28a-BCL-2表达载体,转入大肠杆菌DE3中,SDS-PAGE电泳检测显示,IPTG能够诱导pET28a-BCL-2载体表达,重组蛋白分子量大小为28 kDa左右,与预测一致。利用Ni-NTA His?Bind Resin树脂成功纯化到重组蛋白,质谱测定重组蛋白的相对分子质量为22.77kDa,pH等于8时等电点为4.88,与预测的表达肽段的结果基本一致,重组蛋白表达正确。镉胁迫能够对草鱼肝胰腺的显微结构和抗氧化酶系统造成不同程度的影响。显微结构显示,高浓度镉对草鱼肝胰腺造成明显的组织损伤,中央筋脉堵塞、细胞肥大、细胞核固缩退化等现象被观察到。镉胁迫后草鱼肝抗氧化酶的活性均发生不同程度的变化。与对照组相比低浓度的镉胁迫下,草鱼肝胰腺中SOD酶的活性显著上调,随着各浓度的增加SOD酶活性受到明显抑制(P<0.05);高浓度镉能够抑制肝胰腺的过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)酶活性,脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量随镉浓度升高而显著上调(P<0.05)。