猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为特征的一种传染病。该病毒流行广,对我国养猪业影响大。PRRSV基因组为单股正链RNA,全长为约15 kb,至少编码9个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),具有5′端帽结构,5′非编码区(5′Untranslated region, 5′UTR),3′非编码区(3′UTR)和3′poly(A)尾。PRRSV分为两个基因型:欧洲型(I型)和北美型(II型)。关于PRRSV基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的转录等许多问题尚未解决。病毒负链基因组的复制,亚基因组mRNA的转录均开始于基因组3′末端,所以病毒基因组3′UTR以及poly(A)尾在病毒复制过程中发挥着重要的作用。在本实验室建立的北美型PRRSV感染性克隆的基础上,本研究对病毒基因组的3′UTR以及poly(A)尾巴进行了系列突变,研究病毒基因组RNA末端的顺式调控元件(cis-acting element)在病毒复制过程的调控作用。具体做了如下的研究:1. PRRSV基因组3′UTR的一级序列和二级结构的生物信息学分析利用生物学信息学软件Clustal W,RNAalifold,Mfold等对来自GenBank中128株PRRSV基因组3′UTR序列进行了分析。结果发现:PRRSV两个基因型间3′UTR序列核苷酸同源性在69.3%~77.2%之间,但基因组末端存在高度保守的序列(5′-AGUCACCUAUUCAAUUAGGG UGGG GGC AACCA CCG AAUU-3’),这为下一步的研究3′UTR构效关系提供了重要的信息。对PRRSV 3′UTR二级结构分析发现,PRRSV 3′UTR具有保守的二级结构。两型均具有一个长的凸茎环结构,并且在顶端存在一个高保守的小茎环结构,另外末端还有一个段核苷酸单链,这种结构可能对病毒复制是必需的。2. PRRSV 3′UTR末端系列突变对病毒复制影响的研究针对PRRSV基因组3′UTR一级序列,本研究利用定点突变PCR对特定位置碱基进行替换、插入、缺失,最后经过酶切及测序鉴定成功构建了11个全长突变体,将这些突变体转染MARC-145细胞,利用间接免疫荧光来检测病毒核衣壳(N)蛋白,结果表明:病毒3′UTR保守序列对病毒复制是必需的。保守序列的替换,缺失都使病毒失去感染能力(infectivity)。这些保守序列可能做为病毒或细胞蛋白的识别位点。对非保守区序列的替换发现这些区域对病毒复制是非必需的,但对其缺失会使病毒失去复制能力。说明序列在二级结构或更高级结构上发挥着重要作用。另外,外源序列的插入会使病毒失去感染性,说明病毒3′末端不能耐受碱基的插入,也说明3′末端具有精细的调控元件。3. PRRSV 3′UTR末端序列5′-AAUU-3′对病毒复制影响的研究单股正链RNA病毒基因组末端的碱基在其基因组的复制,亚基因组的转录过程中往往发挥着重要的作用。本研究旨在解析这个高度保守的序列在病毒复制过程中的作用方式及可能的机制。利用定点突变PCR,对存在于PRRSV基因组末端的5′-AAUU-3′序列进行逐一系列突变,构建了12个突变体,经转染MARC-145细胞后,只有突变体pAM04T,pAM04G,pAM04C,pAM01C可以拯救出病毒。突变体转染MARC-145细胞72小时后,用间接免疫荧光分别检测MARC-145细胞中N蛋白和nsp2蛋白(非结构蛋白2)的表达情况,结果表明3′末端第一位的碱基可以被替换成C,第二,三位碱基是不能被任何碱基替换的,而第四位的碱基可以被替换成其他任何碱基,但删除该碱基却不能拯救出病毒。证明了PRRSV 3′UTR的3′末端4个碱基是病毒复制所必需的。特异碱基A3U2是病毒基因组复制和亚基因组转录起始所必需的。最后,对拯救的病毒进行了病毒空斑形态学比较,结果发现突变病毒3个病毒(vAM04T,vAM04G,vAM04C)与亲本病毒在空斑形态学上是完全相同的。而有一个病毒(vAM01C)的空斑比亲本病毒要大。4.全长感染性cDNA克隆pAPRRS进行末端加入丁型肝炎病毒(HDV)核酶本研究目的是在的全长感染性cDNA克隆pAPRRS基因组末端插入HDV反基因组型(anti-genome ribozyme)核酶序列,核酶通过自我剪切功能可以让病毒的基因组能够获得一个精确的3′末端,为进一步研究病毒poly(A)尾奠定基础,本研究利三步PCR将长84 nt的核酶序列插入到pAPRRS的poly(A)之后,并在核酶序列的后面插入了牛生长激素多聚腺甘酸信号序列,用于转录终止。测序结果表明:含有核酶序列的PRRSV全长质粒pAPRRS-HB构建成功,用新改造的pAPRRS-HB转染MARC-145细胞,能够很好的拯救出PRRSV,而且用pAPRRS-HB转染MARC-145细胞效率比用pAPRRS转染有所提高,TCID50结果显示,可提高10倍左右。5. Poly(A)对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组感染性的影响poly(A)在提高mRNA的稳定性和翻译效率上具有重要作用。PRRSV病毒含有poly(A)尾,但其作用还未见报道。本研究旨在研究poly(A)在病毒复制过程中的调控作用。在全长克隆pAPRRS-HB的基础上,对病毒poly(A)进行突变,获得了poly(A)长度为0,1,2,3,4,5,8,10的突变体,8个突变体经测序证实构建成功,分别将含有不同长度poly(A)的突变体转染MARC-145细胞,结果发现:突变体pAMA0,pAMA1,pAMA2,pAMA3均不能拯救出病毒,而突变体pAMA4,pAMA5,pAMA8,pAMA10可以拯救出病毒,说明病毒复制所需要的poly(A)腺苷酸残基的数目最少为4个。为了进一步确定突变体在细胞内的蛋白表达情况,突变体转染MARC-145细胞,转染72小时后,以间接免疫荧光分别检测MARC-145细胞中N蛋白和nsp2蛋白的表达情况,结果发现:突变体pAMA0,pAMA1,pAMA2,pAMA3转染的细胞中,N蛋白和nsp2蛋白均检测不到,说明病毒poly(A)在病毒的复制过程中对病毒基因的翻译、RNA合成以及RNA稳定性起着调控作用。随后用TCID50方法对不同突变体转染的细胞上清中的病毒量进行检测,结果发现:随着poly(A)长度的增加,病毒复制水平有所升高。poly(A)长度为10A时与亲本病毒复制水平没有明显区别。poly(A)长度为4A时病毒在一个较低的水平进行复制。