【摘 要】
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目的:(1)克隆中国安徽流行区间日疟原虫达菲血型结合蛋白 II区基因(Plasmodium vivax Duffy Binding Protein region II,PvDBPII);(2)体外原核表达和鉴定重组PvDBPII蛋白。 方法:(1)根
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目的:(1)克隆中国安徽流行区间日疟原虫达菲血型结合蛋白 II区基因(Plasmodium vivax Duffy Binding Protein region II,PvDBPII);(2)体外原核表达和鉴定重组PvDBPII蛋白。 方法:(1)根据GenBank收录的间日疟原虫Sa1-1株PvDBPII基因(GI:156081788)序列设计引物,从镜检阳性的间日疟原虫感染血样本中抽提 DNA为模板,应用PCR技术从间日疟基因组DNA中扩增DBPII基因。PvDBPII PCR产物与pET-28a载体分别经Nco I和Hind III双酶切后连接克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建pET28a(+)-PvDBPII重组表达质粒,采用双酶切及测序方法鉴定重组质粒。(2)将重组质粒pET28a(+)-PvDBPII转化至大肠埃希菌BL21(DE3+)中,IPTG诱导表达带有His标签的重组蛋白,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用 SDS-PAGE电泳和Western Blotting分析鉴定表达产物。 结果:(1)PCR体外扩增得到目的基因片段长约1.1 kb。双酶切及测序结果显示目的基因己被正确地连接入重组质粒 pET28a(+)中,其插入片段序列与Sa1-1株PvDBPII基因参考序列相比存在四个非同义突变位点(R319G、D384G、R390H和L424I)。(2)重组质粒转入大肠埃希菌后,诱导表达的重组蛋白分子量约为44 kDa,且能被间日疟患者血浆特异性识别。在37℃,IPTG0.5 mmol/L诱导表达4h可达到最大表达量,表达产物为不可溶包涵体。 结论:成功克隆了中国安徽流行区间日疟原虫 PvDBPII基因,表达出了重组PvDBPII蛋白,并优化了 PvDBPII重组蛋白的原核表达条件,验证了其抗原性,为进一步研究基于PvDBPII的红内期间日疟疫苗提供了基础。
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