【摘 要】
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目的:构建突变型p53反义表达载体,研究突变型p53外显子8反义RNA(ASp53exon8RNA)转染对乳腺癌细胞系MDA-MB-231(含突变型p53外显子8)突变基因表达的阻断作用及细胞生长抑制作
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目的:构建突变型p53反义表达载体,研究突变型p53外显子8反义RNA(ASp53exon8RNA)转染对乳腺癌细胞系MDA-MB-231(含突变型p53外显子8)突变基因表达的阻断作用及细胞生长抑制作用.方法:以免疫组化筛选突变型p53细胞系、PCR-SSCP法及基因测序确定靶基因;构建含突变p53外显子8的反义表达载体和制备突变p53反义核酸单链;反义核酸直接加入无血清细胞培养液或生理盐水内,或利用脂质体介导转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,计算细胞生长抑制率,测定MTT吸收值以观察转染细胞的代谢水平;TUNEL法检测转染细胞的凋亡状态,免疫组化检测反义核酸抑制突变型p53表达的效果.结果:1、乳腺癌细胞系MDA-MB-231的p53基因第8外显子存在突变,62位密码子由精氨酸突变成赖氨酸.2、成功构建制备反义和正义突变型p53外显子8 RNA的SP6/T7双向启动子的重组反义表达载体,体外条件下转录反义和正义mt-p53 exon8 RNA.3、基因工程产物ASp53exon8RNA通过胞饮作用及脂质体介导作用渗入乳腺癌细胞系MDA-MB-231后,引起:①癌细胞系增殖能力下降,无血清细胞培养液组、生理盐水组和脂质体介导组的48h生长抑制率分别为28.90﹪,31.80﹪和21.65﹪.②转染48h后MTT吸收值下降,显示细胞代谢受抑制,活力下降.③转染48h后免疫组化结果示小部分细胞突变型p53蛋白的合成被完全抑制,部分抑制不完全,其余则未被抑制.其中脂质体介导组突变型p53蛋白的合成受抑制程度比其余两组明显.④脂质体介导ASp53exon8RNA转染MDA-MB-231细胞12h,24h,48h和72h免疫组化结果示,转染12h后,突变型p53基因表达即开始被阻断,24h时阻断作用最强,随后阻断作用逐渐下降,至72h完全消失.结论:该实验构建的反义表达载体所制备的基因工程产物ASp53exon8,RNA转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231,能特异性阻断细胞内突变型p53基因的表达和抑制转染细胞的生长.
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