苹果矮化自根砧再生芽体系的建立与优化

来源 :山东农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chrong
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在苹果种植生产中,矮化密植不仅是提高土地利用率的有效途径,而且便于管理。目前实现苹果矮化密植的最有效的方法是使用矮化砧木。矮化砧木在一定程度上能控制果树的大小,还具有结果早,丰产早等优点。苹果矮化自根砧在生产中主要以扦插、压条、分株等方式进行繁殖。建立一套苹果矮化自根砧的高效再生芽体系在苹果生产和育种中具有重要的理论与现实意义。苹果矮化自根砧‘T337’是应用较为广泛的砧木品种。其优点主要有:树体矮小,利于矮化密植;结果早,产量高;果实大,色泽明亮品质好;便于日常管理,生产所需成本较低。然而其再生芽体系尚未建立。本研究以‘T337’叶片为外植体,通过诱导愈伤组织分化不定芽建立其再生芽体系、并通过根癌农杆菌介导的遗传转化法将MdWUS1基因成功导入到苹果矮化自根砧‘T337’中,进一步提高了‘T337’再生芽的频率。取得以下研究进展:建立了‘T337’高效再生芽体系:以‘T337’叶片为外植体,研究了激素浓度配比、外植体暗培养时间、不同发育时期幼苗的叶片、不同着生节位叶片对再生芽的影响。结果表明诱导‘T337’叶片再生芽体系的最佳培养基为:MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂(pH5.8),外植体最佳暗培养时间为14天,最佳幼苗的生长年龄为45天,最佳叶片生长节位为自上向下第2-3节叶片,再生芽频率和平均再生芽数分别达到90%以上和3以上。拟南芥AtWUS1是茎端分生组织中的干细胞调控基因,其过表达能够促进拟南芥芽的发生。为进一步提高‘T337’再生芽效率,我们通过遗传转化的方式,将拟南芥AtWUSCHEL(AtWUS)的同源基因MdWUS1转化到‘T337’中。具体结果如下:以‘T337’叶片为外植体,在黑暗条件下预培养2天后,农杆菌培养到菌液浓度为OD600=0.4-0.6时侵染外植体8分钟,使农杆菌充分接触切口细胞,在共培养培养基中加入20 mg/L AS(乙酰丁香酮)共培养2-3天,特美汀(Tm)200 mg/L抑菌培养2天后进行潮霉素(HYG)3 mg/L选择压筛选培养,在进行5-7次继代筛选培养后,获得抗性苗。实验中发现以200mg/L Tm进行抑菌培养和3 mg/L HYG进行筛选培养抑菌效果和筛选效果最佳;以10mg/L E2(雌二醇)为诱导培养基中诱导剂浓度,诱导培养7天表达载体表达效果最佳。提取经过筛选培养后的抗性苗叶片总DNA进行PCR检测,结果证明已成功获得‘T337’转基因植株。利用qRT-PCR分析发现转基因植株中MdWUS1转录水平上调,表型观察显示,经诱导后转基因‘T337’再生芽频率大幅度增加。综上,本研究成功建立了苹果矮化自根砧木‘T337’的再生芽体系,并将MdWUS1基因成功转入‘T337’中,进一步提高了再生芽的频率。
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