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目的:通过全基因组亚硫酸氢盐测序技术(WGBS)研究肾阴虚不孕患者和正常女性卵巢颗粒细胞全基因组DNA甲基化图谱及甲基化差异表达基因，并进行功能验证。观察滋肾经典方药六味地黄颗粒对肾阴虚不孕患者IVF-ET结局的影响及其表观遗传学证候本质。
方法:(一)选取肾阴虚不孕及非肾阴虚不孕行辅助生殖治疗的女性各60例，分别为肾阴虚组及正常对照组。两组患者均采用常规IVF促排方案，取卵日留取卵泡液，分离冻存颗粒细胞。观察两组患者获卵数、2PN受精率、可用胚胎率、优质胚胎率及临床妊娠率。WGBS技术获得两组患者全基因组甲基化图谱，通过GO及KEGG分析，获得肾阴虚不孕的目标基因及通路。
(二)选取辨证属肾阴虚不孕拟行IVF治疗的女性120例，以随机数字表法分为治疗组与对照组，每组60例。另选取非肾阴虚不孕拟行IVF治疗的女性60例为正常对照组。三组患者分别在IVF治疗前两个月经周期给予六味地黄颗粒或安慰剂治疗。三组患者均采用常规IVF促排方案，取卵日留取卵泡液，分离冻存颗粒细胞。观察治疗前后患者肾阴虚证候评分的变化、获卵数、2PN受精率、可用胚胎率、优质胚胎率及临床妊娠率。RT-PCR技术验证三组患者卵巢颗粒细胞中候选差异基因mRNA表达水平。
结果:(一)临床数据分析显示，肾阴虚不孕患者2PN受精率(52.9％vs61.8％)、优质胚胎率(48.5％vs59.5％)及临床妊娠率(39.7％vs63.8％)明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);获卵数及可用胚胎率，肾阴虚患者略低于正常对照组，差异无统计学意义(P＞0.05)。六味地黄颗粒治疗后，患者2PN受精率(60.5％vs53.2％)、优质胚胎率(59.2％vs47.7％)及临床妊娠率(58.6％vs37.9％)明显改善，差异具有统计学意义(P＜0.05);但获卵数及可用胚胎率变化不明显(P＞0.05)。
(二)测序结果显示，肾阴虚与非肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞DNA甲基化存在显著差异。CG位点差异甲基化区域(DMR)分析显示:共发现7498个DMR。这些DMR的GO注释结果显示这些DNA差异甲基化调控候选基因主要涉及133个生物学过程(生物调节、代谢过程及发育过程等)，定位于55个细胞组分(细胞、细胞膜及细胞器等);具有44个分子功能(连接、转运蛋白等)。DMR的KEGG分析结果显示，这些差异调控候选基因主要参与69个通路(卵巢类固醇合成、雌激素合成、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路及细胞连接等)。其中，本研究重点关注了与卵巢激素合成和与颗粒细胞增殖及凋亡密切相关的基因，包括CYP17A1、17β-HSD、ERβ、FOXO3a、mTOR。这些基因可能是肾阴虚不孕患者不孕、月经紊乱、阴中干涩、五心烦热等症状的DNA甲基化调控基因。
(三)实时荧光定量PCR验证上述目标基因，结果显示:①肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞mTOR、ERβmRNA水平明显低于正常对照组，六味地黄颗粒治疗能够逆转肾阴虚不孕患者mTOR、ERβmRNA的表达，这一结果与甲基化测序结果一致。②肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞FOXO3a mRNA水平明显高于正常对照组，六味地黄颗粒治疗能够降低FOXO3a mRNA的表达，这一结果与甲基化测序结果相反。③肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞CYP17A1、17β-HSD mRNA水平与正常对照组相比，差异无统计学意义。
结论:卵巢颗粒细胞mTOR和ERβ基因异常甲基化可能是肾阴虚患者卵母细胞质量下降及肾阴虚证候出现的核心病机之一，两者作为肾阴虚证候生物标志物和补肾中药六味地黄颗粒的调控靶点，为肾主生殖理论的表观遗传学证候本质研究提供了依据。
方法:(一)选取肾阴虚不孕及非肾阴虚不孕行辅助生殖治疗的女性各60例，分别为肾阴虚组及正常对照组。两组患者均采用常规IVF促排方案，取卵日留取卵泡液，分离冻存颗粒细胞。观察两组患者获卵数、2PN受精率、可用胚胎率、优质胚胎率及临床妊娠率。WGBS技术获得两组患者全基因组甲基化图谱，通过GO及KEGG分析，获得肾阴虚不孕的目标基因及通路。
(二)选取辨证属肾阴虚不孕拟行IVF治疗的女性120例，以随机数字表法分为治疗组与对照组，每组60例。另选取非肾阴虚不孕拟行IVF治疗的女性60例为正常对照组。三组患者分别在IVF治疗前两个月经周期给予六味地黄颗粒或安慰剂治疗。三组患者均采用常规IVF促排方案，取卵日留取卵泡液，分离冻存颗粒细胞。观察治疗前后患者肾阴虚证候评分的变化、获卵数、2PN受精率、可用胚胎率、优质胚胎率及临床妊娠率。RT-PCR技术验证三组患者卵巢颗粒细胞中候选差异基因mRNA表达水平。
结果:(一)临床数据分析显示，肾阴虚不孕患者2PN受精率(52.9％vs61.8％)、优质胚胎率(48.5％vs59.5％)及临床妊娠率(39.7％vs63.8％)明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05);获卵数及可用胚胎率，肾阴虚患者略低于正常对照组，差异无统计学意义(P＞0.05)。六味地黄颗粒治疗后，患者2PN受精率(60.5％vs53.2％)、优质胚胎率(59.2％vs47.7％)及临床妊娠率(58.6％vs37.9％)明显改善，差异具有统计学意义(P＜0.05);但获卵数及可用胚胎率变化不明显(P＞0.05)。
(二)测序结果显示，肾阴虚与非肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞DNA甲基化存在显著差异。CG位点差异甲基化区域(DMR)分析显示:共发现7498个DMR。这些DMR的GO注释结果显示这些DNA差异甲基化调控候选基因主要涉及133个生物学过程(生物调节、代谢过程及发育过程等)，定位于55个细胞组分(细胞、细胞膜及细胞器等);具有44个分子功能(连接、转运蛋白等)。DMR的KEGG分析结果显示，这些差异调控候选基因主要参与69个通路(卵巢类固醇合成、雌激素合成、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路及细胞连接等)。其中，本研究重点关注了与卵巢激素合成和与颗粒细胞增殖及凋亡密切相关的基因，包括CYP17A1、17β-HSD、ERβ、FOXO3a、mTOR。这些基因可能是肾阴虚不孕患者不孕、月经紊乱、阴中干涩、五心烦热等症状的DNA甲基化调控基因。
(三)实时荧光定量PCR验证上述目标基因，结果显示:①肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞mTOR、ERβmRNA水平明显低于正常对照组，六味地黄颗粒治疗能够逆转肾阴虚不孕患者mTOR、ERβmRNA的表达，这一结果与甲基化测序结果一致。②肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞FOXO3a mRNA水平明显高于正常对照组，六味地黄颗粒治疗能够降低FOXO3a mRNA的表达，这一结果与甲基化测序结果相反。③肾阴虚不孕患者卵巢颗粒细胞CYP17A1、17β-HSD mRNA水平与正常对照组相比，差异无统计学意义。
结论:卵巢颗粒细胞mTOR和ERβ基因异常甲基化可能是肾阴虚患者卵母细胞质量下降及肾阴虚证候出现的核心病机之一，两者作为肾阴虚证候生物标志物和补肾中药六味地黄颗粒的调控靶点，为肾主生殖理论的表观遗传学证候本质研究提供了依据。