论文部分内容阅读
CpxRA双组分系统是普遍存在于革兰氏阴性细菌的压力感受应答系统，由位于细胞内膜的组氨酸蛋白激酶CpxA和位于细胞质的响应调节蛋白CpxR构成。此外，位于周质空间的辅助调节蛋白CpxP及位于细胞外膜的脂蛋白NlpE也参与CpxA-CpxR通路的信号转导过程。CpxRA双组分系统通过感应外界环境信号调控不同基因的表达，调节细菌一系列生理功能，应对压力环境。 本文以假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）为研究对象，采用蛋白质组学方法比较了野生型(WT)、cpxA缺失突变株（△cpxA）及cpxR缺失突变株(△cpxR）蛋白表达量差异，初步筛选出假结核耶尔森氏菌CpxRA双组分系统的调控靶标，并进一步验证CpxRA双组分系统是否通过调控这些靶标基因的表达引起细菌的表型变化，分析CpxRA双组分系统在假结核耶尔森氏菌应对压力过程中发挥的功能。论文主要包括以下两部分内容: 1.CpxRA双组分系统调控靶标的初步筛选:通过比较假结核耶尔森氏菌△cpxA及△cpxR突变株相与野生型菌株蛋白的表达量差异，筛选出△cpxA突变株表达量差异倍数大于2或小于0.5(p＜0.05)的蛋白近300个。这些蛋白包括CpxP、CpxR、Degp、三型分泌系统(TypeⅢsecretion system，T3SS)效应蛋白YopE、YopH及其效应因子、脲酶、鞭毛蛋白及侵袭素蛋白(Invasion)等，其中CpxP、CpxR、Degp、YopE、YopH在△cpxA突变株表达上调，与文献报道一致。此外，我们的蛋白组学结果首次发现CpxRA双组分系统调控脲酶的表达。 2.CpxRA双组分系统调控功能分析:采用SDS-PAGE、Western blot、细菌泳动性实验等方法对蛋白组学结果进行进一步验证，发现CpxRA双组分系统抑制T3SS效应蛋白的表达及分泌，并且调控功能不受Na+、K+离子浓度的影响。也发现过表达CpxR会显著抑制细菌的泳动，但这一过程的信号机制尚不清楚。此外，还发现CpxRA双组分系统抑制假结核耶尔森氏菌第四套六型分泌系统(TypeⅥsecretion system，T6SS4)的表达，并且过表达CpxR降低细菌在氧化压力下的存活。虽然CpxR是否直接调控T6SS4尚不清楚，但本研究首次将CpxRA双组分系统与六型分泌系统联系起来。