幽门螺杆菌（H. pylori）为革兰阴性微需氧菌,主要定植于感染患者的胃部,是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因素,与胃癌、胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关,世界卫生组织已将其列为一类致癌因子。H. pylori感染率极高,据统计,世界人群感染率超过50%,我国感染人群超过6亿人,在某些地局部区感染率甚至达到90%以上。虽然H. pylori发现至现在已有超过27年的历史,对其病原病因学、流行病学、致病机制、毒力因子、诊断治疗预防方法等也进行了非常深入的研究,但仍然有很多问题仍不是很清楚,如H. pylori感染的持续性和慢性化机制,H. pylori感染与胃癌之间的关系,H. pylori感染率高但发病率低的原因等等。深入阐明其致病机制,对有针对性地开发治疗的创新药物、设计治疗方案、研制有效的疫苗、制定预防控制措施具有重要的理论指导意义。H. pylori能够成功定植于宿主胃部特殊的生理环境中,粘附胃上皮细胞进而引起多种胃部疾病,与其所具有的种类和数量众多的致病因子密切相关,如与H. pylori毒力直接相关的致病因子CagA、VacA、Urease、Hsp60、NAP、OipA、DupA等;与粘附和定植相关的BabA、SabA、SabB、AlpA、AlpB、IceA、HpaA以及最近几年发现的新的粘附分子HP1188和HP1430等;与耐酸相关的有碳酸酐酶、双组份系统蛋白CrdS/CrdR、ArsR/ArsS等。这些蛋白都与H. pylori的感染和致病有着密切的关系。蛋白质的结构是其发挥功能的基础,致病因子发挥作用与其独特的空间结构密切相关。基于此,本研究拟采用结构生物学的方法,解析与H. pylori致病和重要生理功能密切相关的一些蛋白质的结构,通过结构明确其发挥功能和致病的分子机制,为H. pylori感染和致病机制研究提供理论指导。本研究共筛选了包括毒力因子、粘附分子、耐酸相关蛋白以及参与重要生理功能的酶类等20个以上的靶标,目前成功解析了其中两个蛋白质的结构,另有三个蛋白结晶,部分工作仍在进行中。本论文是对所获得的一些主要实验结果的总结,包括以下几个方面的内容。第一部分为幽门螺杆菌（H. pylori）八聚异戊二烯焦磷酸合成酶（OPPs）的结构解析及酶学机理研究。OPPs催化5个异戊二烯焦磷酸（IPP）与法尼酯焦磷酸（FPP）发生连续的缩合反应,生成40C的八聚异戊二烯焦磷酸（OPP）,OPP组成CoQ的侧链,后者在呼吸链的电子传递中发挥了重要作用,敲除该基因后细菌的生长明显受到抑制,提示其功能的重要性。本研究克隆、表达并纯化了来源于H. pylori的OPPs蛋白,采用该蛋白生长晶体并收集了2.0 ?的高质量衍射数据,采用MAD法解析了OPPs的结构。通过对结构的分析,明确了该蛋白的单体结构和二体组装方式、酶活中心的构象以及参与反应的关键残基等信息,同时分析了该结构与同源结构之间的差异,提出了该家族酶类的底物招募和产物释放机制,并确定了参与反应终止即控制产物长度的关键残基。通过分子对接和建模技术获得了底物IPP、FPP、中间产物GGPP与OPPs的复合物结构,在此基础上提出了trans-异戊二烯家族酶类的可能的催化模型,对该家族酶类的反应机制有了更加深入的认识。第二部分为H. pylori精氨酸酶RocF的结构解析及酶活测定体系的建立。精氨酸酶是尿素循环中的一个关键酶,水解精氨酸生成尿素和鸟氨酸,需要在二价金属离子存在的条件下才能发挥活性,它是H. pylori耐酸体系的重要组成部分,在H. pylori的适应性定植中发挥了重要作用。此外,它还通过减少宿主巨噬细胞生成NO和抑制T细胞增生降低宿主的免疫应答,在H. pylori的免疫逃逸和持续性感染中发挥了重要作用。体内外实验证实,敲除RocF编码基因后,H. pylori的定植数量明显下降,而这正是通过宿主NO合成增加造成的,提示RocF在抗机体天然免疫以及在H. pylori的感染和致病中的重要性。与其他的精氨酸酶相比,RocF有许多不同之处,如在酸性和结合Co²⁺的条件下活性最强,还原剂对其活性影响很大,序列中间有一个13个残基的插入,N端C端也有明显不同等,提示其结构可能与其他精氨酸酶存在差异。基于此,本研究对RocF进行了克隆表达和纯化,生长晶体并采用分子置换法成功解析了其结构,明确了参与离子结合的关键残基以及活性中心的位置,并分析了RocF与其他精氨酸酶序列与折叠方式上的差异。同时建立了酶活测定体系,明确了还原剂对酶活的抑制作用以及RocF对离子的选择性(Co²⁺>Ni²⁺>Mn²⁺)。目前我们正尝试通过获得RocF与抑制剂nor-NOHA和BEC的复合物结构,并结合点突变等实验结果对RocF的催化机理进行深入的探讨。第三部分为博士期间的其他工作,包括,1)H. pylori粘附素HpaA的初步晶体学研究,病原体的粘附和定植是发生感染和致病的前提,HpaA是H. pylori最为重要的粘附分子,在H. pylori与胃上皮细胞的粘附中发挥了重要作用,同时它还具有很强的免疫原性,是一种重要的保护性抗原,广泛用于疫苗的研发。本研究成功实现了该蛋白的可溶性表达,经纯化得到高纯度的蛋白,通过大规模的搜索获得了晶体,但晶体质量不是很好,衍射能力较弱,目前正在对晶体进行进一步的优化。2)热休克蛋白HspA、毒力因子CagA、耐酸相关蛋白ArsS的初步晶体学研究,HspA是一种分子伴侣蛋白,参与其他蛋白的折叠,比同源蛋白多了一段特殊的C端结构域,并且在结合Ni²⁺和Bi³⁺时呈现出不同的寡聚方式。CagA是H. pylori最为重要的毒力因子,通过Ⅳ型分泌系统分泌至宿主细胞,通过与某些蛋白相互作用发生磷酸化,进而通过一些信号通路引起胃上皮细胞极性的改变、紧密连接的破坏、肌动蛋白的交联和拉伸以及细胞运动功能的改变,从而引起相关疾病,并且和胃癌的发生有一定的关系。而ArsR是双组份系统的蛋白,可以感受菌体环境的变化从而调控一些耐酸相关蛋白的表达,与H. pylori耐酸和适应性定植密切相关。前期工作中,对上述完整蛋白或筛选的肽段进行了克隆表达和纯化,经纯化得到了高浓度的蛋白并对蛋白的性质进行了分析,但通过多轮的结晶条件的搜索仍没有获得晶体。3)对硕士期间构建的百日咳疫苗的候选融合蛋白FsS1’进行了进一步的研究,通过结构域的分析认为两个结构域之间通过设计的linker分开,形成两个独立的结构域,二者结构不会受到影响。采用稀释复性的方法对蛋白进行了重新复性并进行了进一步的纯化,得到了性质较好的蛋白,通过免疫家兔并检测特异性IgG抗体水平证实融合蛋白有较好的免疫原性,可作为基因重组百日咳疫苗的候选抗原。