棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆及功能研究

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本文利用PVX病毒载体建立棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)的cDNA文库,采用功能筛选策略克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因(片段)。以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA,采用牙签接种本氏烟(Nicotiana benthamiana),从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中7个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆PBC43编码一个特异的elicitin蛋白;克隆PBC163编码一个Rab蛋白,与大豆疫霉的RAB基因同源性较高;克隆PBC241编码prohibitin蛋白;PBN62编码一个热激蛋白60(HSP60)。还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因,提示可能是该病原菌特异的激发子基因。上述结果表明,利用病毒表达载体建立cDNA文库采用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生HR的激发子基因,该方法可望为其它植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台。 从棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的elicitin基因,命名为Pbelicitin(Phytophthora boehmeriae elicitin)。经southern杂交分析表明,该基因在基因组中至少有5个拷贝。该基因的原核表达产物能诱导野生型烟草Xanthi和不能积累乙烯的Tetre烟草产生过敏反应和对TMV与Phytophthora nicotianae产生系统获得抗性,且能诱导这两种烟草的PR-1a、PR-1b和PR-1c基因的表达,表明Pbelicitin诱导的HR和SAR受不依赖于乙烯的信号途径控制;而该原核融合表达产物只能诱导不能积累水杨酸的转nahG基因烟草NahG产生过敏反应,不能诱导其PR-1a、PR-1b和PR-1c的表达,表明SA不参与该elicitin诱导的HR,而参与其诱导的系统获得抗病性。并且在棉疫病菌与棉花亲和互作中Pbelicitin下调表达的。 从棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae)cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的RAB基因片段,根据公共数据库序列比对后,根据同源序列设计引物,扩增出了该基因的长度为606bp的全长序列,命名为PbRAB。经southern杂交分析表明,该基因在基因组中是单拷贝的。PbRAB基因的原核表达产物处理野生型烟草Xanthi后,发现能够作为效应因子引起烟草的HR反应和H2O2的积累,通过RT-PCR分析表明经处理的烟草在过敏性坏死反应过程中有PR基因的诱导表达。本试验还构建了四个功能突变体,初步分析了引起过敏性坏死反应的功能区域,并确认了基因原核表达产物发挥
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