卵巢上皮性癌在妇科恶性肿瘤中发病率占第三位，与其他恶性肿瘤相比，由于其具有早期无明显临床症状，缺乏特异性的检测指标，初诊时多为晚期，手术和化疗难以治愈，易产生耐药性及复发的特点，致使其死亡率始终居妇科恶性肿瘤首位。因此研究卵巢上皮性癌的发生、发展机制至为重要。近年来随着研究的深入，发现卵巢上皮性癌的发生不仅与遗传学改变有关，也与表观遗传学的改变密切相关。DNA异常甲基化作为表观遗传学的主要方式之一，其导致的相关抑癌基因的表达沉默与卵巢上皮性癌的发生、发展、治疗、预后存在密切的关系。由于表观遗传学的改变具有可逆性，通过药物逆转DNA异常甲基化，使抑癌基因重新表达的治疗则成为目前恶性肿瘤基因治疗的研究热点。但在针对卵巢恶性肿瘤的治疗中，逆转甲基化相关药物的研究仍较少。　　 全反式维甲酸（all-trans Retinoic Acid，ATRA）是一种经典的细胞诱导分化药物，正常情况下其通过与受体（RAR-RXR异二聚体）结合，启动细胞内维甲酸信号传递系统，从而调控靶基因的转录，抑制细胞DNA合成。以往我们的研究已经从分子生物水平、生物能量方面、细胞有丝分裂、细胞骨架等方面证实了其对卵巢上皮性腺癌的治疗作用，但ATRA在逆转DNA甲基化方面对卵巢上皮性腺癌是否也有治疗作用呢？　　 自1987年发现维甲酸受体以来，学者们陆续发现许多恶性肿瘤的发生发展与维甲酸受体的表达异常密切相关。研究较多的为RARβ，因其具有抑制肿瘤细胞生长的作用，作为一种抑癌基因，其在多种肿瘤中表达下调。最近有研究发现，在乳腺癌及血液系统肿瘤中也存在RARα表达下降，而维甲酸介导的RARα激活，可以抑制肿瘤细胞的生长，有效逆转表达下降的趋势，可以在肿瘤的发病及治疗中发挥重要作用。　　 前期我们研究发现一定浓度的ATRA可以上调卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARα基因的mRNA表达，促进肿瘤细胞分化。本实验在该研究的基础上，拟从DNA甲基化方面着手，进一歩探讨ATRA作用后抑癌基因-RARα的mRNA改变可能存在的表观遗传学机制。本实验选用卵巢上皮性腺癌细胞COC2为研究对象，利用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation specific PCR，MSP）检测COC2细胞中是否存在RARα的异常甲基化；如存在异常甲基化，并且药物作用后异常甲基化情况发生改变，再利用基因测序及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）进一步检测各组中RARα基因启动子区DNA甲基化位点的数量及其mRNA的表达情况，了解其mRNA表达改变与甲基化位点数是否存在相关性；同时检测各组中DNA异常甲基化过程中的关键酶—DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b）的mRNA表达，以探讨ATRA是否通过影响DNMT3b的表达使甲基化位点数发生改变。　　 　　 第一部分：全反式维甲酸对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARα基因启动子区DNA甲基化位点及其mRNA的影响　　 目的 ：观察卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中是否存在RARα基因的异常甲基化；如存在异常甲基化情况，不同浓度及作用时间的ATRA干预后，COC2中RARα基因启动子区甲基化位点的改变，以及RARα基因mRNA表达的情况。探讨ATRA对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARα基因的去甲基化作用，ATRA作用后其mRNA表达改变与启动子区甲基化改变可能存在的联系。　　 方法 ：将卵巢上皮性腺癌细胞COC2培养至105个/ml浓度时加药干预，将培养好的细胞分为阴性对照组及ATRA干预组，干预组再分为3小组，分别给予1、5、　　 10μmol/L的ATRA，置于相同条件下培养，每小组分为三瓶，分别维持药物浓度干预3d、6d、9d。提取各组细胞的基因组DNA，用MSP、基因测序的方法检测用药前后COC2细胞中RARα基因启动子区甲基化位点的情况。提取各组细胞中的总RNA，用RT-PCR法检测各组RARα基因mRNA表达的改变。　　 结果 ：COC2细胞中存在RARα基因启动子区异常甲基化；不同浓度及作用时间的ATRA处理后，测序结果显示RARα基因启动子区的异常高甲基化位点数目出现下降趋势，并在一定范围内表现出浓度及时间依赖性。1、5μmol/L ATRA处理3d、6d、9d，及10μmol/L处理3d、6d后，均只有RARα基因启动子的甲基化条带，未出现非甲基化条带，而测序结果表明甲基化位点数随时间的增加有所减少。10μmol/L处理9d后出现微弱非甲基化条带。各ATRA处理组的RARα mRNA的表达与阴性对照组相比均升高，且具有时间、浓度依赖性，当浓度达10μmol/L处理9d后有显著统计学差异（P<0.05）。虽然干预后，RARα基因mRNA表达增加和ATRA逆转甲基化作用增强总的趋势一致，但统计学处理并未显示两种改变数量上的相关性。　　 结论：COC2细胞中存在RARα基因启动子区异常高甲基化；ATRA可以部分逆转卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中RARα启动子区的异常高甲基化位点，同时增加RARα的mRNA表达。　　 　　 第二部分：全反式维甲酸对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中DNA甲基转移酶3b的mRNA表达的影响　　 　　 目的 ：通过检测ATRA对卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中DNA甲基化的关键酶—DNMT3b的mRNA表达的影响，进一步探讨ATRA影响DNA甲基化可能的作用机制。　　 方法 ：细胞分组及ATRA的处理方法同第一部分，提取各组细胞的总RNA，RT-PCR法检测各组中DNMT3b的mRNA表达情况。　　 结果 ：各处理组与阴性对照组相比DNMT3b mRNA的表达均有下降，且具有时间及浓度依赖性。处理9d后，10μmol/L ATRA处理组DNMT3b 的阳性条带灰度值与β-action的比值为（2.243±0.175）与阴性对照组（3.929±0.159）、1μmol/L组（2.787±0.086）、5μmol/L组（2.557±0.215）比较有显著统计学差异（P<0.05）。　　 结论：经ATRA处理后，卵巢上皮性腺癌细胞株COC2中DNMT3b的mRNA表达减弱，并具有时间及浓度依赖性，由此发现ATRA可能通过抑制DNMT3b的表达发挥逆转甲基化作用，使RARα基因mRNA的表达上调。