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背景食管癌(Esophageal carcinoma,EC)治疗产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致化疗失败的主要原因,也是引起肿瘤复发转移的重要因素。研究表明micro RNA(miRNA)与肿瘤细胞产生MDR密切相关。本课题组前期研究表明,miR-145过表达抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡。本研究预实验结果提示:miR-145过表达的食管癌细胞株Eca109对化疗药物顺铂的敏感性有显著影响。为探索miR-145对食管癌多药耐药的影响,本课题拟研究在不同食管癌细胞株Eca109和EC9706中miR-145过表达对化疗药物敏感性的影响并从细胞和分子水平分析其作用机制。研究结果将为进一步阐明miR-145及其靶基因在食管癌耐药中的作用,以及为后续食管癌耐药分子靶向治疗及临床治疗方案的选择等临床转化研究奠定实验和理论基础。目的(1)研究在食管癌细胞Eca109和EC9706中miR-145过表达对顺铂和紫杉醇药物敏感性的影响;(2)研究miR-145过表达对耐药基因MDR1和MVP的影响;(3)研究miR-145过表达对其候选靶基因的影响。方法利用miR-145慢病毒过表达载体(lenti-miR-145)及空载体(lenti-NC)分别转染食管癌细胞Eca109和EC9706建立miR-145稳定过表达细胞株;利用噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2;5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测miR-145过表达的食管癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性;用实时荧光定量PCR(q PCR)法在分子水平检测miR-145和多药耐药基因MDR1(Multidrug Resistance Gene1)、MVP(Majo r Vault Protein)在食管癌细胞Eca109和EC9706细胞株中的表达,使用蛋白质印迹法(Western Blot)检测MDR1、MVP在蛋白水平的表达;通过生物信息学数据库Target Scan(http://www.targetscan.org/),Pictar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和Diana(http://diana.cslab.ece.ntua.gr)确认miR-145的候选靶基因,并使用q PCR法、蛋白质印迹法和荧光素酶报告基因法(luciferase reporter assay)进一步确认YES1(Yama guchi Sarcoma viral related oncogene homolog1)是miR-145的靶基因。结果(1)荧光镜下观察和q PCR检测结果提示,miR-145过表达食管癌细胞成功建立(P<0.001);(2)q PCR分析结果表明,miR-145在顺铂或紫杉醇刺激后的食管癌细胞株EC9706和Eca109中的表达显著降低(P<0.05);(3)MTT检测结果发现,miR-145过表达食管癌细胞株EC9706和Eca109对顺铂和紫杉醇的敏感性均明显增加(P<0.01,P<0.05);(4)q PCR和Western blot检测结果表明,多药耐药基因MDR1和MVP在顺铂或紫杉醇刺激后的食管癌细胞EC9706和Eca109中的表达显著升高(P<0.01);而这两种基因在miR-145过表达的食管癌细胞EC9706和Eca109中的表达显著降低(P<0.05);(5)生物信息学分析,YES1为miR-145作用的候选靶基因。q PCR和蛋白质印记法表明YES1的表达与miR-145的表达呈负相关(P<0.01)。荧光素酶报告基因法表明miR-145调控YES1的表达(P<0.05)。结论(1)miR-145与食管癌细胞EC9706和Eca109的多药耐药密切相关,miR-145过表达可显著提高食管癌细胞株EC9706和Eca109对化疗药物顺铂或紫杉醇的敏感性。(2)miR-145过表达可显著降低多药耐药基因MDR1和MVP在食管癌细胞株EC9706和Eca109中的表达。(3)YES1是miR-145的直接靶基因,并且与MDR1和MVP的表达呈正相关关系,提示miR-145可能通过调控YES1参与调控食管癌细胞的多药耐药,此结果将有助于发现新的食管癌细胞耐药治疗靶点。