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结肠癌(Colon Cancer,CC)是一种常见的消化道恶性肿瘤,因其与直肠癌有较多共同的病理生理特征,通常将其与直肠癌统称为结直肠癌进行研究。近年来,结肠癌的发病率和死亡率均显著升高,并且有年轻化的趋势,结肠癌己对我国居民的生命健康造成了严重影响。随着纤维结肠镜检查的开展,结肠癌的早期诊断取得了一定的进步,但对于中晚期患者来说,其生存率并没有得到实质性改善。因此,进一步探究结肠癌的致病及其转移机制,对改善结肠癌患者的治疗及预后有重要的意义。SLP-2基因在2000年由耶鲁大学病理科发现,其为Stomatin基因超家族的成员。SLP-2蛋白主要分布于细胞膜,参与组成细胞骨架,可通过调控细胞膜上多种离子通道而对细胞信号传导产生作用。此外,细胞线粒体内也分布有SLP-2蛋白,可以调节线粒体膜相关蛋白的稳定性,并对ATP的合成产生一定影响。近年来,越来越多的研究显示,SLP-2与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关,例如:食管鳞癌、乳腺癌、宫颈癌等。但其与结肠癌的关系,仍不甚清楚,因此对其在结肠癌中的功能进行深入研究具有重要的临床意义。本课题主要进行了以下5个方面的研究:第一,检测结肠癌及癌旁正常组织标本中SLP-2mRNA及蛋白表达水平,探讨SLP-2的表达与结肠癌分化程度的关系。第二:通过检测6种实验室常用不同分化程度的结肠癌细胞株中SLP-2mRNA及蛋白的表达水平,探讨SLP-2的表达与结肠癌细胞分化程度的关系。第三:通过siRNA干扰实验,抑制结肠癌细胞SLP-2表达水平,分别采取MTT、流式细胞术、Western blot及qRT-PCR技术检测SLP-2对细胞增殖及细胞周期的影响。第四:通过siRNA干扰实验,抑制结肠癌细胞SLP-2表达水平,分别采取细胞划痕实验、细胞transwell实验、Western blot及qRT-PCR技术检测SLP-2对细胞迁移及侵袭的影响。第五:通过siRNA干扰实验,抑制结肠癌细胞SLP-2表达水平,分别采取Western blot及qRT-PCR技术检测SLP-2对β-catenin及其下游信号通路的影响,探讨影响结肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制。第一部分结肠癌组织SLP-2的表达与结肠癌的关系目的:检测SLP-2在结肠癌及其癌旁正常组织中的表达水平,分析其表达与结肠癌分化水平的关系。方法:选择2017年1月至2018年6月在河北医科大学第四医院外科行根治性手术的结肠癌患者30例,术后及时获取部分结肠癌组织及癌旁组织(距癌组织边缘>2 cm)各1块(约1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm),标本投入液氮速冻,后转入-80℃低温冰箱保存。随后通过qRT-PCR、Western blot方法检测结肠癌组织及癌旁正常组织中的SLP-2的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.结肠癌组织和癌旁组织中SLP-2 mRNA的表达情况荧光定量RT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,结肠癌组织中SLP-2的mRNA表达水平升高,且低分化组织高于高分化组织表达水平,差异有统计学意义(P<0.01)。2.结肠癌组织和癌旁组织中SLP-2蛋白的表达情况Western blot结果显示,与癌旁组织相比,结肠癌组织中SLP-2的蛋白表达水平升高,且低分化组织高于高分化组织表达水平,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:SLP-2的表达水平在结肠癌组织中明显高于癌旁正常组织,且其表达与结肠癌的组织分化程度相关,推测其在结肠癌的发生、演变中发挥重要的作用,具有成为结直肠癌患者早期诊断和治疗的潜在靶点的临床价值。第二部分SLP-2在不同结肠癌细胞株中的表达差异目的:通过检测6种不同分化程度结肠癌细胞株中SLP-2mRNA及蛋白的表达水平,判断其与结肠癌细胞分化程度的关系。方法:选取常见6种结肠癌细胞株(HT29、SW480、SW620、LOVO、Caco-2、HCT116)及正常结肠粘膜上皮细胞NCM460,用qRT-PCR及Western blot的方法,检测SLP-2mRNA及蛋白的表达水平,判断其与结肠癌细胞分化程度的关系。结果:1.SLP-2 mRNA在不同分化水平的结肠癌细胞株中的表达qRT-PCR的结果显示,SLP-2的表达水平与结肠癌细胞分化程度呈负相关,即随着细胞分化程度的下降,SLP-2的表达逐渐升高,SLP2 mRNA在SW620细胞中表达水平最高,组间表达差异有统计学差异(P<0.01)。2.SLP-2蛋白在不同分化水平的结肠癌细胞株中的表达Western blot结果显示,SLP-2的表达水平与结肠癌细胞分化程度呈负相关,随着细胞分化程度的下降,SLP-2的表达水平逐渐增加,SLP-2蛋白在SW620细胞中表达水平最高,组间表达差异有统计学差异(P<0.01)。结论:SLP-2的mRNA及蛋白在各型结肠癌细胞株中的表达不同,表明SLP-2表达水平可能与结肠癌细胞的分化、增殖、迁移及侵袭等生物学功能密切相关。第三部分抑制SLP-2表达对结肠癌细胞株SW620增殖和细胞周期的影响目的:通过转染siRNA干扰细胞中SLP-2的表达,判断SLP-2对结肠癌细胞增殖和细胞周期的影响。方法:设计并订购3条SLP-2mRNA特异性siRNA序列:(SLP-2-siRNA-1,5’-GCAGAGUCUCAAGGAAAUUtt-3’),(SLP-2-siRNA-2,5’-CGACAAUGUAACUCUGCAAtt-3’),(SLP-2-siRNA-3,5’-GGCCAAGGCUAAAGCUGAAtt-3’)及对照control siRNA(NS-siRNA,5’-GGUCUCACUCCCCAUAGAGtt-3’),构建SLP-2高表达质粒及空白对照质粒(Vector),分别用3条siRNA序列高表达质粒转染SLP-2内源性高表达的SW620细胞株,并在转染后不同时间点(24、48、72及96 h)观察SLP-2mRNA及蛋白表达变化,以确定抑制作用最高的siRNA序列及有效的抑制作用时限。筛选构建成功且稳定转染的细胞株后,分别应用MTT、流式细胞术、qRT-PCR及Western blot方法检测抑制SLP-2对细胞増殖和细胞周期的影响。结果:1.SLP-2-siRNAs对SW620细胞SLP-2mRNA及蛋白表达的影响qRT-PCR及Western blot检测结果显示,50nM不同序列的SLP-2-siRNAs转染SW620结肠癌细胞48 h后,SLP-2的mRNA及蛋白表达均有不同程度下降,其中SLP-2-siRNA-2对SLP-2的抑制作用最佳。而细胞转染control-siRNA后SLP-2mRNA及蛋白表达没有明显改变。为了确认SLP2抑制作用的时限,我们检测了不同时间(24,48,72及96 h)SLP-2-siRNA-2转染SW620结肠癌细胞对SLP-2 mRNA表达的影响。qRT-PCR及Western blot检测结果显示,50 nM的SLP-2-siRNA-2转染SW620细胞后,SLP-2的mRNA及蛋白表达水平明显降低,相比于转染control-siRNA对照,其中48、72及96 h时SLP-2 mRNA及蛋白表达均下降了80%以上。后续实验均对50nM SLP-2-siRNA-2序列转染48h的SW620结肠癌细胞进行检测。2.SLP-2-siRNA转染对SW620细胞增殖活性的影响MTT结果显示,SLP-2-siRNA转染SW620细胞48h,细胞增殖活性明显降低。同时,细胞增殖标志基因PCNA的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。3.SLP-2-siRNA转染对SW620细胞周期的影响流式细胞学检测结果显示,SLP-2-siRNA转染SW620细胞48h,细胞周期进程受到抑制,G0/G1期细胞比例明显增加。同时,细胞周期素cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:SLP-2-siRNA-2能够有效的降低结肠癌SW620细胞株表达SLP-2。抑制SLP-2表达能够显著抑制结直肠癌细胞SW620的増殖及细胞周期进程。第四部分抑制SLP-2表达对结肠癌细胞侵袭、迁移的影响目的:通过转染siRNA干扰细胞中SLP-2的表达,以判断SLP-2对结肠癌细胞侵袭及迁移能力的影响。方法:SLP-2-siRNA-2(5’-CGACAAUGUAACUCUGCAAtt-3’)及对照control siRNA(NS-siRNA,5’-GGUCUCACUCCCCAUAGAGtt-3’)序列高表达质粒转染SLP-2内源性高表达的SW620细胞株,并在转染后48 h,分别应用细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测抑制SLP-2对细胞侵袭、迁移能力的影响;应用qRT-PCR及Western blot方法检测抑制SLP-2对细胞侵袭、迁移相关蛋白及基因表达的影响(ICAM1、MMP2、MMP7和MMP9)。结果:1.SLP-2抑制对SW620细胞迁移活性的影响细胞划痕实验结果显示:SLP-2-siRNAs转染48h,对SW620细胞的迁移活性具有明显的抑制作用(P<0.05)。2.SLP-2抑制对SW620细胞侵袭活性的影响Transwell侵袭实验结果显示:SLP-2-siRNAs转染48h,对SW620细胞的迁移活性具有明显的抑制作用(P<0.05)。3.SLP-2抑制对SW620细胞侵袭、迁移相关基因及蛋白表达的影响qRT-PCR及Western-blot结果显示:SLP2-siRNAs转染48h,SW620细胞ICAM1、MMP2、MMP7和MMP9的mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05),但对TIMP1和TIMP2表达没有明显影响。结论:抑制SLP-2能够明显著抑制结肠癌细胞SW620的迁移及侵袭能力。第五部分抑制SLP-2表达对β-catenin信号通路上下游分子的影响目的:通过转染siRNA干扰细胞中SLP-2的表达,判断SLP-2对结肠癌细胞β-catenin及其下游信号通路的影响,探讨SLP-2影响结肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制。方法:SLP-2-siRNA-2(5’-CGACAAUGUAACUCUGCAAtt-3’)及对照control siRNA(NS-siRNA,5’-GGUCUCACUCCCCAUAGAGtt-3’)序列高表达质粒转染SLP-2内源性高表达的SW620细胞株,并在转染后48 h,分别应用qRT-PCR及Western blot方法检测抑制SLP-2对SW620细胞β-catenin及其下游信号通路相关蛋白及基因表达的影响(GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、Survivin、cyclin D1和c-Myc)。结果:1.SLP-2抑制对SW620细胞β-catenin及其上、下游信号通路分子mRNA表达的影响qRT-PCR结果显示:SLP-2-siRNAs转染SW620细胞48h后,β-catenin上游分子GSK3β的mRNA表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而β-catenin及其下游分子Survivin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。2.SLP-2抑制对SW620细胞β-catenin及其上、下游信号通路分子蛋白表达水平的影响Western-blot结果显示:SLP-2-siRNAs转染48h后,β-catenin上游分子GSK3β的蛋白表达及其磷酸化水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而β-catenin及其下游分子Survivin、cyclin D1和c-Myc的蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:SLP-2通过影响β-catenin信号通路,影响结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。