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近年来我国的前列腺癌发病率逐年升高。对于局部和全身转移的进展期患者，临床尚无较好的治疗方法。基因治疗自上个世纪九十年代初用于肿瘤的治疗研究以来，被认为是治疗包括前列腺癌等恶性实体肿瘤最有前途的方法。但现阶段基因治疗肿瘤的发展正受一些技术难点的困扰，其中缺乏在体内安全、有效的基因载体问题是瓶颈之一。本研究先以第5代阳离子聚酰胺-胺型树枝状聚合物(Generation 5 Polyamidoamine Dendrimers，G5-PAMAM-D)为基因载体，载含自杀基因HSV4k和表达小发卡RNA(shRNA)的质粒，在体内外进行实验性治疗研究，并在此基础上应用转铁蛋白(Tf)对G5-PAMAM-D进行修饰，获得具有前列腺癌靶向性的载体G5-PAMAM-D-Tf，再以PAMAM-D-Tf为载体携表达shRNA的质粒进行靶向前列腺癌的组织特异性RNA干扰治疗研究。为前列腺癌的基因治疗寻找安全、高效、并有靶向性的基因载体。本研究分3个部分第一部分G5-PAMAM-D介导HSV-tk／GCV系统对前列腺癌生长的抑制目的考察PAMAM-D作为自杀基因HSV-tk／GCV系统载体进行前列腺自杀基因治疗的可行性。方法以第5代PAMAM-D(G5-PAMAM-D)为载体将含增强型荧光蛋白(EGFP)基因片段的质粒pEGFP-C1转染至前列腺癌细胞系PC-3和22Rv1，成功表达EGFP后，再以G5-PAMAM-D将含HSV-tk自杀基因的真核表达质粒pcDNA3-tk转染至前列腺癌细胞系PC-3和22Rv1，转染48h后，对转染的两种细胞给予不同浓度的前体药更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)，24h后采用MTT比色法测定药物对细胞增殖的影响。制作前列腺癌皮下荷瘤小鼠模型，将G5-PAMAM-D／pcDNA3-tk复合物瘤内注射，24h后腹腔注射GCV，观察这一复合物体内对肿瘤生长的抑制作用。结果荧光观察及FCM结果证明G5-PAMAM-D可将pEGFP-C1转入2种前列腺癌细胞并表达EGFP。采用G5-PAMAM-D将pcDNA3-tk质粒转染PC-3和22Rv1细胞，给不同浓度的前体药GCV后，实验组细胞与对照组相比有明显浓度依赖性生长抑制，说明PAMAM-D作为载体可在体外将HSV-tk自杀基因递送至前列腺癌细胞中，并在细胞中进行表达，从而使HSV-tk／GCV自杀基因系统发挥杀伤细胞的作用。荷瘤小鼠模型在给予瘤内注射G5-PAMAM-D／pcDNA3-tk，行腹腔注射GCV治疗后第40天，治疗组肿瘤体积与2个对照组相比肿瘤生长明显被抑制(P＜0.01)，生存时间延长。结论G5-PAMAM-D可做为前列腺腺癌自杀基因治疗的基因载体，有良好的应用前景。第二部分PAMAM-D介导STAT3-shRNA对前列腺癌生长的抑制作用目的考察G5-PAMAM-D作为小发卡RNA(small hairpin RNA，shRNA)真核表达质粒的载体，进行前列腺癌RNA干扰基因治疗的可行性。方法根据增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和信号转导子和转录激活子3(STAT3)cDNA序列结构分别设计构建表达EGFPmRNA、STAT3mRNA特异的shRNA真核表达质粒pSilencing4.1-EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA。在体外以G5-PAMAM-D为载体将质粒pEGFP-C1和pSilencing4.1-EGFP-shRNA共转染前列腺癌细胞PC-3、22Rv1，通过观察EGFP表达反映干扰效果以及转染效率。再以同样的方式将pSilencing4.1-STAT3-shRNA转入前列腺癌细胞系，MTT法检测对细胞生长的抑制作用，丫啶橙染色观察细胞凋亡。制作前列腺癌小鼠模型，将G5-PAMAM-D与质粒pSilencing4.1-STAT3-shRNA的混合物注射入荷瘤鼠肿瘤内，观察对肿瘤生长的抑制作用。结果体外实验表明G5-PAMAM-D可将pSilencing4.1-EGFP-shRNA转入前列腺癌细胞，并明显沉默EGFP的表达，同样可将pSilencing4.1-STAT3-shRNA有效转入前列腺癌细胞中，明显抑制肿瘤细胞的生长，增加细胞的凋亡。体内实验证明G5-PAMAM-D／pSilencing4.1-STAT3-shRNA可抑制荷瘤鼠前列腺癌的生长，而各对照组肿瘤生长无明显抑制。结论G5-PAMAM-D作为基因载体，可将shRNA的真核表达质粒在体内外转入前列腺癌组织细胞，并有效表达shRNA，G5-PAMAM-D可能成为应用前景广阔的小干扰RNA(siRNA)的载体。第三部分转铁蛋白修饰的G5-PAMAM-D介导shRNA特异性沉默列腺癌基因表达的研究目的本部分研究将转铁蛋白与G5-PAMAM-D连接，得到肿瘤选择性载体G5-PAMAM-D-Tf，并应用其作为shRNA真核表达质粒的载体，在体外进行转染干扰实验，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性的载体进行前列腺癌RNA干扰基因治疗的可行性。方法先用二硫键法以转铁蛋白(Transferrin，Tf)修饰的G5-PAMAM-D，得到靶向性载体G5-PAMAM-D-Tf。以G5-PAMAM-D-Tf为载体将pSilencing4.1-EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA在体外转染不同细胞，用荧光观察、RT-PCR、Western blotting及MTT法观察对不同细胞中外源性基因EGFP和内源性性基因STAT3的抑制作用，考察G5-PAMAM-D-Tf靶向性和有效性。结果G5-PAMAM-D-Tf可特异性地将pSilencing4.1-EGFP-shRNA和pSilencing4.1-STAT3-shRNA转入前列腺癌细胞，沉默其EGFP和STAT3的表达，而在正常组织细胞EGFP和STAT3的表达抑制不明显。STAT3沉默导致的生长抑制也特异性地发生在前列腺癌细胞。结论G5-PAMAM-D-Tf作为一种靶向性的基因载体，可以将shRNA的真核表达质粒靶向性地转入前列腺癌细胞。提高RNAi治疗的安全性。