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酯酶（E.C 3.1.1.x,Esterases）主要包括羧酸酯酶（E.C 3.1.1.1,Carboxylesterases）和脂肪酶（E.C 3.1.1.3,Lipases）,可以催化酯键和酰胺键的断裂和形成,在油脂、食品、化学合成、医药、洗涤剂、造纸和纸浆、皮革等行业有广泛的应用。传统的酶基因筛选方法基于微生物的培养与纯化,但自然界中99%以上的微生物是不可培养的,丰富的酯酶基因资源尚未被开发。宏基因组技术绕过了微生物的培养阶段,直接从环境中提取总DNA,构建基因文库,通过对文库进行筛选来获得目的基因,目前宏基因组技术已经成为发现新型酯酶的有效工具。本研究以功能筛选的方法从土壤宏基因组文库中筛选酯酶基因,获得新型羧酸酯酶基因dlfae4,在大肠杆菌BL21（DE3）实现了dlfae4的异源表达,对DLFae4的酶学性质进行了表征,并对酶与配体复合物进行分子动力学模拟。主要结果如下:1、酯酶基因的筛选。使用功能筛选的方法在宏基因组文库中筛选到一个新型酯酶基因dlfae4,Blast分析表明其最高序列相似性仅为54%,基因长1017bp,编码338个氨基酸残基,预测蛋白分子量为37.2kDa,等电点为7.77,多序列比对结果显示DLFae4具有SXXK基序,该基序在第Ⅷ族酯酶和C类β-内酰胺酶中是高度保守的,DLFae4与第Ⅷ族酯酶还具有多个相似基序,系统进化分析显示DLFae4与第Ⅷ族酯酶聚为一支。2、酯酶的异源表达。通过PCR和酶切酶连的方法,将dlfae4基因克隆到pET-28a表达载体中,构建pET-dlfae4重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,使用镍柱亲和层析纯化重组酶,SDS-PAGE验证蛋白条带单一,分子量与预测相一致。以pET-dlfae4为扩增模板,设计引物引入点突变位点,构建了S11A、K14N和Y121A三个定点突变体,它们的酶活性几乎完全丧失,表明推定的三联体Ser11-Lys14-Y121对催化反应起关键作用。利用蛋白凝胶层析技术,基于蛋白分子量的对数与保留体积的反比关系,确定了 DLFae4在天然状态下为二聚体。3、酶学性质表征及底物特异性。DLFae4的最适pH为8.6,最适温度为50℃,在pH=6-9.5之间可以保持较高的活性,60℃孵育3h仍然具有50%活性,热稳定性良好,Cu2+对DLFae4的活性具有强烈抑制作用,乙醇、甲醇、SDS对酶活也有较强的抑制作用,其他测试的添加物对酶活影响不大。DLFae4可以降解C2-C8侧链长度的对硝基苯酯（p-NP）和四种羟基肉桂酸甲酯,对阿魏酸甲酯（MFA）的活性最高,达123.78U/mg,另外还对5种邻苯二甲酸酯（PAEs）具有水解活性。4、DLFae4对内酰胺类化合物的水解活性研究。由于与C类β-内酰胺酶高序列相似性,DLFae4表现出对三种内酰胺化合物的水解作用,分别是青霉素钾（21.24U/mg）、氨苄青霉素（35.78U/mg）、头孢唑林钠（11.33U/mg）也具有水解活性,对氨苄青霉素的水解活性高于部分专一的C类β-内酰胺酶。5、DLFae4分子动力学模拟初步研究。以蛋白4IVK为模板,构建DLFae4的三维模型,采用Autodock软件,对DLFae4和底物MFA进行分子对接,获得蛋白-底物复合物作为输入文件。通过Gromacs进行分子动力学模拟,经过构建拓扑文件、定义盒子和溶剂化、添加离子、能量最小化和平衡步骤,使体系稳定,对体系进行分子动力学计算,结果显示MFA上的2号羰基氧可能与Gly102上的氨基H产生氢键,整个系统在10 ns的模拟过程中较稳定。最终计算得到DLFae4与MFA之间的非键合相互作用总能量为-129.89kJ/mol,两者结合紧密,DLFae4对MFA有较高的催化活性。本研究中的DLFae4是第Ⅷ族羧酸酯酶,含有保守的SXXK基序,与C类β-内酰胺酶具有高序列相似性且对氨苄青霉素具有高水解活性,它具有良好的热稳定性,60℃孵育3h仍然具有50%的活性,可以水解短链对硝基苯酯和四种羟基肉桂酸甲酯,它是首个报道可以水解PAEs的第Ⅷ族羧酸酯酶。这些特性使得它在工业和生物降解环境塑化剂上有潜在的应用价值,并对酯酶的进一步研究和工程开发有重要意义。