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[研究背景与目的]肺癌的发病率和死亡率居全球恶性肿瘤首位,非小细胞肺癌(Non small cell lung cance,NSCLC)占肺癌的85%,腺癌是其中很重要的一种类型,易早期发生转移。大多数肺癌患者确诊时已是晚期,5年生存率约为15%。因此筛选出方法简便、灵敏性和特异性高,有助于肺癌早期诊断的肺癌标记物或肺癌相关基因意义重大。有学者在做NSCLC全基因组芯片分析时发现,基于高变异幅度和小重叠区域,磷脂酰肌醇蛋白聚糖6(Glypican6,GPC6)可能是一个新的促癌基因。因此,我们收集NSCLC(腺癌)临床样本检测了 GPC6基因在肿瘤组织及瘤旁组织中的表达情况,并通过体外实验研究来了解干扰GPC6基因对肺癌细胞增殖功能的影响,通过生物信息分析系统(Ingenuity pathway analysis,IPA)对全基因表达谱芯片实验结果进行分析,结合蛋白免疫印迹(Western blotting,WB)对多个关键基因的验证结果,对GPC6基因影响肺癌细胞增殖的可能作用机制进行初步探讨。[方法](1)用免疫组化方法对10位肺腺癌患者的肿瘤组织及瘤旁组织染色,检测GPC6基因在肿瘤组织及瘤旁组织的蛋白表达情况。用实时定量聚合酶链反应(Real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测 GPC6 基因在不同肺腺癌细胞株中的mRNA表达。(2)以GPC6基因为模板设计干扰靶点,构建RNA干扰慢病毒载体,包装后感染人A549和H1299细胞敲减GPC6基因。用RT-qPCR检测mRNA水平GPC6基因敲减效率;用WB检测GPC6基因被敲减后的蛋白表达,验证靶点干扰效果。分别用Celigo成像血细胞计数器(Celigo image cytometer,Celigo)、四甲基偶氮唑盐比色法(Methye thiazolye telrazlium,MTT)、荧光激活细胞分选术(Fluorescence activated cell sorting,FACS)和半胱天冬酶 3/7 检验(Caspase 3/7 assay,Caspase3/7)检测 A549和H1299细胞的增殖及凋亡变化。(3)RNA干扰慢病毒感染人A549细胞敲减GPC6基因,通过全基因表达谱芯片实验检测GPC6基因敲减后A549细胞的基因变化,运用IPA对GPC6基因敲减后的结果进行经典通路分析、上游调控分析、疾病和功能分析、调控效应分析和互作网络分析及深入分析,并构建基因网络图。(4)根据全基因表达谱芯片实验结果,对STAT3、MET、CEBPB、PTGS2(COX2)、JUN、FOS、CXCL8(IL8)和SHC1等基因用WB进行验证。[结果](1)GPC6基因在肺腺癌患者的肿瘤组织及瘤旁组织中存在差异表达(肿瘤组织中高表达,瘤旁组织中低表达)(P<0.05),在人95-D、A549、H1299和H1975细胞中均存在mRNA表达,在95-D细胞中表达较低,在A549、H1299和H1975细胞中表达较高。(2)Celigo、MTT检测发现:GPC6基因敲减后的人A549和H1299细胞的增殖速率均受到显著抑制(均P<0.01)。FACS、Caspase3/7检测发现:GPC6基因敲减后的人A549和H1299细胞发生凋亡的细胞均显著增加(均P<0.01),caspase3/7活性均显著增强(均P<0.01)。(3)全基因表达谱芯片实验结果显示人A549细胞的GPC6基因被敲减后,显著上调基因876个,显著下调基因935个,差异倍数(Fold change,FC)值为-1.2340816(P=0.008695449);肺癌常见驱动基因EGFR、BRAF、MET和RET非显著上调,ALK、ROS1、HER2和KRAS非显著下调;具有NF-kB活性的REL、RELA和RELB基因下调。IPA分析提示GPC6基因在人A549细胞上可能通过调控肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)及 IL6 等信号通路上的 STAT3、MET、CEBPB、PTGS2(COX2)、JUN、FOS、CXCL8(IL8)、SHC1、RAP1A 及 IL1R1 等基因影响肿瘤细胞的增殖。(4)下游基因WB验证结果显示STAT3蛋白表达上调26%,MET蛋白表达下调1%,CEBPB蛋白表达下调67%,PTGS2(COX2)蛋白表达显著下调,JUN蛋白表达上调205%,FOS蛋白表达下调46%,CXCL8(IL8)蛋白表达下调49%,SHC1蛋白表达上调87%。[结论]GPC6基因在肺腺癌患者的肿瘤组织及瘤旁组织中存在差异表达;干扰GPC6基因对人A549和H1299细胞有抑制其增殖的作用;GPC6基因在人A549细胞上通过调控 PTGS2(COX2)、CEBPB、CXCL8(IL8)、STAT3、FOS 和 SHC1 等下游基因而发挥以上作用;GPC6基因敲减后的STAT3基因高表达是人A549细胞增殖受抑的重要原因,该抑制效应可能通过STAT3/NF-kB/IL8轴及CEBPB/NF-kB/IL8轴起作用。