本研究旨在利用SV40T抗原基因能促进细胞永生化的功能，采用真核表达质粒pcDNA3.0为载体，用分子克隆技术构建含SV40T抗原基因的重组质粒pcDNA3.0-SV40T，然后利用脂质体转染技术，将SV40T基因片段成功导入经纯化的鹅小肠上皮细胞，使其与细胞DNA整合发生同源重组。最后通过从转染细胞中提取DNA和总RNA，以SV40T抗原基因序列设计特异性引物，利用PCR和RT-PCR检测表明SV40T基因能在转染的真核细胞中有效表达。从而，重组质粒pcDNA3.0-SV40T为进一步构建永生化细胞系奠定了基础，为利用SV40T抗原基因进行细胞永生化研究提供了稳定、可靠的分子工具。　　 本试验旨在探索鹅小肠上皮细胞体外培养的条件及简便可行的分离纯化方法，得到纯度较高的鹅小肠上皮细胞。本试验取29-30日龄的鹅胚为试验材料，通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养，采用刮除法、相差消化及相差贴壁法对上皮细胞进行纯化，用0.05％Trypsin-EDTA进行消化传代，通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定。采用MTT显色法定量研究了不同温度(37℃、39℃)、不同浓度的CO2(2.5％～10％)和不同浓度的FBS(5％～7.5％)对鹅原代小肠上皮细胞生长的影响。结果表明：通过组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好，细胞活性较强，经过纯化，得到了纯度较高的鹅小肠上皮细胞：而联合使用浓度为300U/mL的胶原酶(Ⅺ型)和0.1mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位，但传代后其增殖能力明显下降。形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性，证明分离来的细胞为小肠上皮细胞，从而为鹅小肠上皮细胞的永生化研究提供较好了细胞材料。鹅小肠上皮细胞在39℃条件下的增殖能力略优于其在37℃时的；在5％～7.5％CO2下的增殖速度相对较快；FBS用量则应以5％～7.5％为宜。　　 本试验设计并构建含有SV40T基因的重组表达质粒pcDNA3.0-SV40T，为小肠上皮细胞永生化研究提供稳定、可靠的分子工具。通过将质粒pGEM-SV40T进行XhoI单酶切获得SV40T基因片段，并将其插入真核表达质粒pcDNA3.0中，用分子克隆技术构建重组质粒pcDNA3.0-SV40T。经酶切鉴定和测序证实，SV40T基因片段已经成功地正向插入质粒pcDNA3.0中，重组质粒pcDNA3.0-SV40T构建成功。　　 本试验采用脂质体转染技术，将含有SV40T基因的重组表达质粒pcDNA3.0-SV40T导入经纯化的鹅小肠上皮细胞，通过基因组DNA PCR和RT-PCR检测SV40T基因在鹅小肠上皮细胞中的表达情况。根据设计的不同引物序列扩增，基因组DNA PCR和RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分别扩增出429bp和225bp的特异性条带，表明SV40T基因在鹅小肠上皮细胞中成功表达。从而，重组质粒pcDNA3.0-SV40T为进一步构建永生化细胞系奠定了理论基础。