高效厌氧解磷菌丁酸梭菌A5-4的初步研究

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土壤中有效磷的缺乏已成为限制农业生产的重要因素之一。解磷微生物通过分泌有机酸和相关酶将土壤中的无效磷转化为植物可吸收利用的有效磷,在自然界磷素生物地化循环中起到了关键性作用。施用解磷微生物来降低农业生产成本、提高作物产量是当前研究的热点。从武汉郊区的水稻田、堆肥和养猪场化粪池等地土壤筛选到6株高效厌氧解磷菌,其中A5-4菌株溶解磷酸钙和植酸钙能力分别为204.7 mg/L和58.3 mg/L;在以植酸钙为唯一磷源的PVK液体培养基中,A5-4的植酸酶和碱性磷酸酶酶活分别达3.97 U/mL和1.897 U/mL;水稻盆栽试验结果表明,接种A5-4的水稻苗生长49d后,水稻株高、根长、鲜重、干重及叶片含磷量与对照相比分别提高了37.3%,72.2%,64.7%,76.4%和38.1%;植物促生因子PGRs(Plant growth regulators)试验发现A5-4能合成吲哚乙酸(IAA)和分泌嗜铁红素。对其分别进行形态学观察、生理生化试验,并结合16SrDNA基因序列比对分析,鉴定为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。进一步考察了丁酸梭菌A5-4在无机磷液体培养基、有机磷液体培养基以及水稻盆栽土壤中的解磷特征,结果表明:(1)在有机磷源和无机磷源培养基中,解磷量变化与生物量的变化间呈现出较好的相关性;(2)植酸酶和磷酸酶的分泌需有机磷底物的诱导,且主要集中在丁酸梭菌A5-4的对数生长期;(3)有机磷的解离与pH相关性不明显,而无机磷的溶解与pH呈明显负相关;(4)溶磷过程中丁酸梭菌A5-4分泌了6种有机酸,总含量达到2.659 g/L;(5)接种丁酸梭菌A5-4处理后水稻根际土壤的可溶性磷含量、植酸酶和磷酸酶酶活在整个试验过程中(0-49d),都明显高于对照。通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心组和设计和响应面方法,优化丁酸梭菌A5-4的培养基组成和培养条件。优化的培养基组成为(g/L):葡萄糖23.41,酵母粉4.42,蛋白胨7.23,K2HPO4·3H2O 2.90, MgSO4·7H2O 0.60, NaCl 0.45, KCl0.30, FeSO4·7H2O 0.03, MnSO4·H2O 0.015。优化的培养条件:灭菌前pH7.5,发酵温度37℃,种龄12 h,接种量3%,发酵时间36 h。在优化工艺条件下,丁酸梭菌A5-4菌体浓度可达1.12±0.11×109 CFU/mL。
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