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胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,约占颅内肿瘤的40 %[1-2],尽管一些治疗方法包括手术治疗、放射疗及化疗有很大进展,但是胶质瘤病人特别是恶性胶质瘤的预后仍然很差[3-6]。迫切需要寻求有效的非手术的治疗方法[7-10]。随着肿瘤分子生物学、分子遗传学的研究进展,对胶质瘤发病机制认识的深入,以及DNA重组和基因转染技术的发展,使胶质瘤基因治疗成为可能[11-13]。这些研究虽处于发展阶段,但表现了良好的前景[14-15,17-20]。本研究采用新型的自杀基因系统CYP2B1/IFO gene system对胶质瘤进行体外治疗取得较好结果,并对疗效和机制进行了探讨。一、CYP2B1新型自杀基因的真核表达载体的构建和瞬时表达目的构建一种新型的CYP2B1自杀基因表达载体并检测其在肿瘤细胞中的表达。方法根据gene bank中鼠CYP2B1基因的核苷酸序列设计一对引物,以pc3/2B1为模板进行PCR扩增,将PCR CYP2B1基因产物定向插入到pcDNA3.0中,构建CYP2B1基因表达载体pcDNA3.0/CYP2B1;通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3.0/CYP2B1转染三种肿瘤细胞株(human glioma U 251M G cell lines、人成神经胶质瘤SHG44细胞株、HeLa),RT-PCR检测CYP2B1基因在各细胞株中的表达。结果目的片段均成功插入相应的载体中, CMV启动子调控下的CYP2B1基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论CMV启动子调控的CYP2B1真核基因表达载体是肿瘤基因治疗中一种有效的治疗载体。二、三种不同启动子调控下CYP2B1基因真核表达载体的构建及表达目的:分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通用启动子和CMV杂合启动子[HRE] CMV调控的CYP2B1基因表达载体并检测、分析二者表达的特点。方法:将[HRE]启动子插入载体pcDNA3.0,构建胶质瘤细胞特异表达载体p[HRE] CMV;将CYP2B1基因分别插入pcDNA3.0和p[HRE] CMV,构建两种启动子调控的CYP2B1基因表达载体pcDNA3.0/CYP2B1和p[HRE] CMV /CYP2B1;经酶切、PCR及测序鉴定各重组体。用脂质体介导法将两CYP2B1基因载体转染三种不同细胞株(human glioma U 251M G cell lines、人成神经胶质瘤SHG44细胞株、HeLa),RT-PCR检测CYP2B1基因在各细胞株中表达,分析二者表达的特点。结果:各目的片段均成功插入相应载体中,CMV启动子调控的CYP2B1基因在各株细胞中均实现了表达,而[HRE] CMV启动子调控的CYP2B1基因则在三种胶质瘤细胞中实现了较强的表达。结论:两种CYP2B1基因表达载体是胶质瘤基因治疗研究中新型、高效的表达载体, p[HRE] CMV /CYP2B1在三种胶质瘤细胞中实现了较强的表达。三、CYP2B1/IFO系统治疗胶质瘤的杀伤作用目的:探讨CYP2B1/IfO自杀基因系统对胶质瘤细胞的杀伤作用。方法:构建CYP2B1基因真核表达载体pcDNA3.0/CYP2B1,脂质体介导法将其导入human glioma U 251M G cell lines细胞,利用G418筛选获得稳定转染CYP2B1基因的细胞株human glioma U251M G cell lines/CYP2B1。台盼兰据染法检测细胞生长曲线,MTT法和FCM检测细胞对IFO的敏感性及旁观者效应,HPLC检测CYP2B1酶活性。结果: human glioma U251M G cell linesCYP2B1细胞对IFO十分敏感,作用4d后human glioma U251M G cell lines/CYP2B1的IC50为4.5μM,而100μM的IFO即可最大限度地杀死human glioma U251M G cell lines/CYP2B1细胞。100μM IFO作用8d后,混合细胞中human glioma U251M G cell lines/CYP2B1比例仅占10%即可导致所有细胞死亡。HPLC结果显示,CYP2B1基因产物能够将IFO转化为phosphoramide mustard。结论:CYP2B1/IFO系统对胶质瘤细胞的杀瘤效果明显优于传统的自杀基因系统,可以将其应用于胶质瘤基因治疗,尤其是体内治疗。,通过以上研究得出以下结论:1.成功构建CYP2B1基因表达系统。2.在体外p[HRE] CMV /CYP2B1启动子调控下CYP2B1可实现较强的表达。3.CYP21/IFO系统对胶质瘤细胞有很好的杀伤作用。p CMV /CYP2B1 and p[HRE] CMV /CYP2B1的构建为下一步体内抗胶质瘤特异杀伤作用的研究打下了基础。