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鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)主要是由1型鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus 1,DHAV-1)引起的、针对雏鸭的一种高传染性和高致死率的传染病。迄今为止对DHAV-1临床检测手段主要采用中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等。本研究通过DHAV-1 VP1优势抗原区域的筛选截短表达5个蛋白,以VP1-a(1-60aa)重组蛋白制备兔抗DHAV-1多克隆抗体;建立了以VP1-a作为包被抗原的间接ELISA方法。为临床上DHAV-1和DHAV-1血清的快速诊断检测提供了方法。1.VP1蛋白截短片段原核表达通过生物信息学软件DNAStar以及在线蛋白质分析网站对DHAV-1 VPl进行抗原性分析,综合分析结果选取VPl蛋白的5个抗原性较强的区域进行截短,将截短蛋白的DNA序列克隆至pET-32a(+)表达载体中,选用表达菌Rosetta(DE3),37℃、0.4 mmol/L IPTG诱导表达6 h,获得与预期大小相符的重组蛋白VP1-a、VP1-b、VP1-c、VP1-d和VP1-e。Western blot分析表明,除截短重组蛋白VP1-d不能与鸭抗DHAV-1阳性血清反应外,其余4个截短重组蛋白均能与鸭抗DHAV-1阳性血清反应并以VP1-a的反应最强烈。本研究表达得到的4个具备良好反应原性的截短重组蛋白为DHAV-1及抗体的检测提供了基础材料。2.兔抗DHAV-1 VP1-a高免血清的制备和应用选取重组蛋白VP1-a并切胶纯化后免疫兔,获得VP1-a的多克隆抗体,间接ELISA方法检测抗体效价为1:512000。用制备的兔抗VP1-a高免血清分别进行间接免疫荧光和免疫组化检测DHAV-1在体外DEF感染细胞及感染鸭肝组织内病毒的分布情况,结果显示在体外DEF感染细胞中病毒主要分布在细胞质,少量分布在细胞核;感染鸭肝组织中病毒主要分布于肝细胞的细胞质。上述实验说明兔抗VP1-a高免血清能很好地识别DHAV-1,表明构建的重组蛋白VP1-a具有良好的免疫原性和反应原性,其制备的抗体可用于DHAV-1的检测。3.基于VP1-a蛋白的间接ELISA方法的建立用VP1-a蛋白作为包被抗原建立检测DHAV-1抗体的间接ELISA方法。最佳抗原包被浓度为2.875 ng/μL,最佳血清稀释度为1:160,最适二抗稀释度为1:400;最佳封闭液为5%BSA;阳性临界值为0.461,阴性临界值为0.394,介于二者之间判定为可疑;板内平均变异系数为2.43%,板间平均变异系数为3.15%;不与鸭瘟病毒、鸭流感病毒、鸭坦布苏病毒等免疫血清发生交叉反应。VP1-a与DHAV-1全病毒作为包被抗原的间接ELISA检测方法同时检测临床样本,两种方法的符合率是84%。因此,应用VP1-a重组蛋白作构建的间接ELISA方法特异性强、重复性好,可以用于DHAV-1临床血清抗体的检测。