论文部分内容阅读
炭疽(Anthrax)是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)感染引起的一种急性、烈性人畜共患和自然疫源性的传染病,由于这种疾病的症状类型之一是引起皮肤等组织发生黑炭状坏死,故称为“炭疽”。本病原菌几乎遍及全世界,农民、牧民、皮毛加工与动物屠宰以及畜牧兽医工作者都最容易感染。近年来,针对重组PA疫苗的保护率低的弊端,对炭疽杆菌的预防单纯依靠PA抗原人们提出了异议,除了PA外,是否存在别的保护性分子和PA一起对炭疽病的预防起着作用成了人们研究的一个新方向。首先,通过对中国炭疽PA疫苗具有保护作用的抗原成份进行了定性分析,保护性抗原成份通过高压液相纯化证实分子量为32 ku的蛋白,此值低于一直以来公认的PA分子量(83 ku)。将生产的中国炭疽PA疫苗进行SDS-PAGE电泳,切取具有保护性作用的目的条带进行蛋白质指纹图谱分析(MALDI-TOF-MS)。根据MALDI-TOF结果分析,该蛋白确定为炭疽中性蛋白酶(neutral protease,NPR),而不是PA。第二,选取了炭疽杆菌保护性抗原PA、中性蛋白酶NPR和中性蛋白酶的保守位点N蛋白编码基因为研究对象,PCR扩增炭疽杆菌PA、N和NPR编码基因,分别与克隆载体pGEM-T连接后测序,将测序正确的片段分别与原核表达质粒pET28a(+)和pQE80-L连接,分别构建重组原核表达质粒pET28a-PA,pET28a-N和pQE80-NPR。通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物,Western Blotting方法鉴定结果显示重组质粒可表达PA、NPR和N蛋白。第三,重组蛋白经亲和纯化后加Al(OH)3佐剂免疫Balb/c小鼠,检测细胞免疫和体液免疫指标,ELISA方法检测小鼠血清中总IgG水平免疫组显著高于PBS对照组(P<0.01),抗体亚型分类检测结果显示IgG1水平显著提高,淋巴细胞增殖实验证实T淋巴细胞增殖活性有明显的增强,重组蛋白具有生物学活性;CD分子测定表明以诱发Th2型免疫应答为主,说明重组蛋白候选疫苗免疫在机体内成功地增强了Th2型体液免疫为主的免疫应答。第四,在预试验的基础上,重组蛋白免疫Balb/c小鼠后经炭疽杆菌Vollum株攻毒,结果显示,所构建候选蛋白疫苗对10 LD50剂量均可产生部分保护。