光皮桦(Betula luminifera)既是优先推广的优质珍贵用材树种,也是林木遗传研究的理想材料。材性改良是现阶段光皮桦育种的重要内容之一,然而同其他树种一样,如何缩短其选择周期,加快遗传改良进程,是急需解决的难题。该问题的解决有赖于对其木材品质性状遗传基础的了解和掌握程度。近年来,一种基于第二代测序平台的RNA-Seq技术已被成功应用于非模式木本植物重要性状关键候选基因的挖掘和分子机制的解析。本论文在原有工作基础上,进一步研究明确光皮桦应拉木的特殊材质表型及其与内源激素分布的关系；同时应用RNA-Seq深度分析转录组特征和应拉木形成早期阶段的基因表达模式,挖掘与木材材性形成联系的关键候选基因。其主要结果如下：1.光皮桦经40天的拉弯处理,应拉区木质部的细胞壁明显增厚,纤维平均双壁厚是对应木的1.5倍,形成了明显的胶质纤维层。应拉木的平均纤维长度、纤维素含量均明显大于对应木,而木质素含量则表现相反。3个处理时间应拉木中蔗糖、果糖含量皆高于对应木和直立木的数值,说明应拉木形成早期阶段碳流已朝纤维素合成方向转变。同阶段应拉区IAA含量皆小于对应区,但仅处理7天的木质部样品两区块间差异达到显著水平。GA和BR也表现出与IAA类似的变化规律。而ZR含量在两区块木质部间皆无明显差异,但表现出随处理时间延长而增加的趋势。可见,IAA等激素的重新分布可能不是导致光皮桦应拉木形成的起始因素。2.利用Illumina的Hiseq2000平台对光皮桦8种组织的转录组进行了深度测序,总共获得2.1×107个Reads,产生1.9Gbp的序列数据。经拼接得到54,777个Unigenes,平均长度443bp,总碱基数达24.20Mb.通过与NR和Swiss-Prot数据库的比对,65.8%(35,920)的Unigenes得到了注释信息,涉及24,482个不重复的蛋白序列号。同时,7,954和9,997个Unigenes分别获得了GO和COG分类信息,且15,427个Unigenes被匹配到125个代谢通路。通过基因名搜索和序列比对,19个参与纤维素、木质素合成途径酶的编码基因被鉴定,而且其中多数基因在光皮桦基因组中表现为多成员家族。为了验证转录组测序获得的结果,15个参与纤维素、木质素合成基因的全长cDNA被克隆。经序列比对,28个Unigenes覆盖了这些目标基因的不同区域,且序列一致性达96.0%以上。进一步的定量PCR分析不仅验证了15个目标基因存在的真实性,而且表达模式结果能基本匹配相应功能注释信息。本次转录组测序获得的序列信息为光皮桦后续功能基因组研究奠定了坚实基础。3.以转录组测序获得的相关序列为基础,利用RACE技术分离到8个光皮桦纤维素合成酶基因BICesA的全长cDNA序列,对应的编码蛋白分别由985-1,103个氨基酸残基组成,且每个蛋白都具有植物CESA蛋白特有的基序。8个BICESA氨基酸序列间一致性变幅为55-82%,而它们与相应具最高相似度的毛果杨PtriCESA氨基酸序列间的一致性高达81-92%。进化树构建分析发现BlCESA1、BlCESA3和BlCESA4分属于3个与次生壁形成相关的类群；BlCESA2、BlCESA5、BlCESA6、BlCESA7和BlCESA8则分属于3个与初生壁形成相关的类群。进一步的定量PCR分析,表明BICesA1、BlCesA3和BlCesA4等3个基因主要在木质化茎段的木质部表达,且经激素和蔗糖处理后,这3个基因的表达变化趋势完全一致,暗示可能构成一种同工型。然而在拉弯处理实验中,虽然这3个基因在应拉区木质部中的表达皆明显大于对照样品,但BlCesA4在对应区木质部中的表达变化与BlCesA1、BlCesA3不同。BlCesA2、BlCesA6和BlCesA7主要在叶片、韧皮部中表达,在功能上可能主要参与初生壁的形成。BlCesA8虽与BlCesA6具有较高序列相似度,但主要在幼叶、韧皮部和形成层表达,且在激素、蔗糖和拉弯处理下两个基因的表达皆存在一定差异,该基因可能不只是在初生壁的形成中发挥作用。4.运用基于RNA-Seq的数字表达谱技术对应拉木形成早期阶段(拉弯处理6h到7d)的应拉区木质部(包括对照样品)进行了基因表达谱分析,共检测到44,680个Unigenes表达,其中符合筛选条件的差异表达Unigenes有4,567个,涉及至少1,151个代谢途径。从GO分类结果看,差异表达Unigenes至少包含40个亚类,且光皮桦拉弯处理总体会导致相关代谢增强、酶活提高。进一步对21个参与纤维素、木质素合成相关酶编码基因的表达特征进行分析,共检测到163个编码这些酶的Unigenes在该发育阶段表达,其中109个发生了明显的表达变化,且76个(69.7%)在次生木质部特异或优势表达。纤维素合成途径中主要酶编码基因多数呈现明显的上调表达,较好地印证了光皮桦应拉木中纤维素含量增加及胶质层存在的事实。以部分编码CesA、SUS和KOR的Unigenes为指导基因进行基因共表达分析,发掘到3个可能参与光皮桦应拉木形成的MYB和OVATE类转录因子。在编码参与苯丙烷途径主要酶的基因序列中,有多个在次生木质部优势表达的Unigenes却呈现上调表达；而在木质素单体特异途径中,多数注释为CCR、CAD和SAD的Unigenes表现为明显的下调表达,表明应拉木中木质素含量相对下降可能主要与木质素单体途径中的酶基因有关。此外,在该应拉木形成早期阶段,多数注释为生长素反应因子和诱导蛋白的Unigenes呈现明显的下调表达趋势,而超过半数的外输载体基因却发生了显著的上调表达。以上研究结果不仅为光皮桦木材形成分子遗传基础的进一步解析奠定了基础,而且为后续分子标记开发和辅助育种提供重要序列信息和依据。