褪黑素是松果腺分泌的一种多功能分子,它不仅能调节昼夜节律和季节性动物繁殖,而且在调节动物生殖方面也起着重要的作用。研究证明,褪黑素对卵泡的发育、卵母细胞的成熟和胚胎发育起着重要的作用。本研究主要是探讨外源性褪黑素对水牛卵母细胞体外成熟的影响,并对其相关作用机制进行探究,以期进一步优化卵母细胞体外成熟的培养体系,为阐明水牛卵母细胞成熟的机制提供一定的理论依据。首先,检测了水牛卵丘细胞和卵母细胞上褪黑素的两种受体MT1和MT2的表达情况。结果发现,在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2。其次,探究了在体外成熟培养液中添加不同浓度褪黑素(0M、10-9M、10-8M、10-7M)对水牛卵母细胞体外成熟及其随后体外受精胚胎的发育的影响。结果显示：水牛卵母细胞在添加不同浓度的褪黑素(10-9M、10-8M、10-7M)的成熟液中成熟培养22-24h后,每个处理组的卵母细胞第一极体排出率均显著高于未添加组(50.30% vs 47.56%、53.04% vs 47.56%、50.63% vs47.56%,P<0.05),且浓度为10-8M组卵母细胞的极体排出率显著高于10-9M和10-7M组(P<0.05)。随后,将各组成熟培养24 h后的卵母细胞进行体外受精,发现受精后各处理组胚胎的分裂率显著高于未添加组(60.23% vs57.62%、65.26% vs 57.62%、62.84% vs 57.62%,P<0.05),而且10-8M和10-7M组的胚胎能发育到囊胚的比例显著高于未添加组(20.48% vs15.22%、18.68 vs 15.22%,P<0.05),但10-9M组的囊胚发育率与未添加组相比差异不显著(16.44% vs 15.22%,P>0.05)。最后,探讨了褪黑素对卵母细胞成熟影响的作用机制。结果发现：在成熟液中单独添加同等浓度的褪黑素受体拮抗剂(LZU,10-8M),水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(47.44% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(57.18% vs 58.42%)和囊胚率(15.06% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显著(P>0.05)；而单独添加同等浓度的褪黑素受体激动剂(IIK7,10-8M)时,水牛卵母细胞成熟培养后的极体排出率(51.25% vs 48.15%)、体外受精后胚胎分裂率(64.15% vs 58.42%)和囊胚率(19.04% vs 15.26%)均显著高于未添加组(P<0.05),但与单独添加褪黑素组(MT,10-8M)卵母细胞的极体排出率(51.25% vs 52.94%)、体外受精后胚胎的分裂率(61.24% vs 64.32%)和囊胚率(18.52% vs 19.36%)相比,差异不显著(P>0.05)；当同时添加褪黑素(MT,10-8M)和褪黑素受体拮抗剂(LZU，10-8M)时,水牛卵母细胞成熟后的极体排出率(48.19% vs 48.15%)、体外受精后胚胎的分裂率(58.13% vs 58.42%)和囊胚率(15.23% vs 15.26%)与未添加组相比,差异不显著(P>0.05)。对卵母细胞活性氧进行检测,结果发现褪黑素处理组卵母细胞成熟后细胞内的活性氧含量显著低于未添加的对照组(P<0.05)。利用激光共聚焦显微镜检测卵母细胞线粒体的分布和线粒体膜电位的变化情况,结果显示：褪黑素处组水牛卵母细胞线粒体呈扩散型分布的数量及线粒体的膜电位均显著高于未添加组(P<0.05)。利用酶标检测cAMP、cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶含量的变化,发现褪黑素处理组的卵母细胞内cAMP的含量显著低于未添加组,而cGMP、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的含量显著高于未添加组(P<0.05)。荧光定量PCR检测抗氧化基因GPX4和SOD1、卵丘扩展相关基因PTX3 和 HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达情况,结果显示：经褪黑素处理能显著上调水牛卵母细胞GPX4、SOD1、MT1和MT2的表达,而且也显著上调了卵丘细胞上卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2以及褪黑素受体基因MT1和MT2的表达水平(P<0.05)。上述结果表明：(1)在水牛卵丘细胞和卵母细胞上均存在褪黑素受体MT1和MT2;(2)在水牛成熟液中添加适当浓度(10-8M)的褪黑素有利于水牛卵母细胞体外成熟以及其胚胎发育潜能的获得；(3)褪黑素能抑制卵母细胞cAMP的合成、促进卵母细胞cGMP的合成,同时上调卵丘扩展相关基因PTX、HAS1、HAS2口上调受体基因MT1、MT2的表达；(4)褪黑素能促进卵母细胞中抗氧化物酶的合成,清除细胞活性氧,并上调抗氧化物酶的基因表达。