骨髓基质不仅分泌多种因子调节造血干细胞的增殖与分化，而且其本身也存在一种非造血组织干细胞，即骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，现已越来越受到研究者的关注。MSCs是一类具有强大自我复制能力和多向分化潜能的细胞，除分化为中胚层的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他结缔组织外，特定条件下还可以分化为肺细胞、心肌细胞、肝细胞以及神经细胞等。MSCs不仅存在于骨髓中，而且存在于脐血、外周血、以及脂肪等组织中，但骨髓是其最重要的来源。 骨髓MSCs来源丰富，取材容易，且能迅速培养、增殖，弥补了神经干细胞取材困难的特点，自体移植又避免了免疫排斥反应，因而作为神经细胞的另一来源，用于中枢神经系统疾病或损伤的细胞治疗，具有更广阔的应用前景。在抗氧化剂的诱导下，MSCs可定向分化为神经元样细胞，但诱导后的神经元样细胞体外存活时间短。神经节苷脂(gangliosides，GM1)具有神经重塑作用，外源性GM1可促进体外培养的神经细胞芽生和轴突生长，然而其对MSCs诱导分化的神经元样细胞是否有作用，尚未见报道。 目的： 探讨MSCs向神经细胞体外定向诱导分化的可行性，以及GM1对MSCs分化郑州大学2004届硕士研究生学位论文大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化及神经节营脂对神经元样细胞的影响的神经元样细胞的保护作用。为MSCs在神经科学领域的研究和应用奠定实验基石出。 材料与方法: 取成年健康SD大鼠股骨和胫骨骨髓，密度梯度离心法分离获取骨髓单个核细胞(mononuclear eells，MNCs)。多次洗涤后，将细胞沉淀接种于含10%胎牛血清(FBs)的低糖DMEM(L一DMEM)培养液中，置于37℃、5%C仇、饱和湿度的CO:孵箱中培养，细胞融合后用0.25%胰酶消化传代。培养3一6代的细胞接种于塑料培养皿中，待细胞铺满80%培养皿时，采用碱性成纤维生长因子(basicflbroblast growth ractor， bFoF)培养24h，以促进细胞的增殖。然后实验组细胞应用二甲亚矾(dimet场1 sulfoxide，nMSO)和丁轻茵醚(butylated场droxyanisole，BHA)对大鼠MSCs(rMSCS)进行体外定向诱导分化;对照组细胞(未诱导细胞)不加任何诱导剂。应用免疫细胞化学方法检测诱导lh、3h后神经干细胞标记物一巢蛋白(nestin)的表达，以及诱导sh后神经元标记物一神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NsE)和星形胶质细胞标记物一胶质细胞纤维酸性蛋白(glail fibrillary acidi。protein，GFAP)的表达，分别计数各种分化细胞的阳性率。 诱导sh后，分别用含三种不同浓度GMI的DMEM培养液对分化的细胞进一步培养，另设DMEM组、血清组和诱导液组，分别用不含血清的DMEM培养基、含10%FBS的DMEM培养液和含抗氧化剂的诱导液继续培养，24h、48h后分别用免疫细胞化学方法对各组细胞进行NSE鉴定。 结果: 1.分离后的大鼠骨髓MSCs(rMSCS)在体外培养条件下，呈增殖性生长。传代后的rMSCS约7d左右可扩增一倍。 2.rMSCS经诱导lh后，即有部分细胞呈现神经元样形态，诱导sh结束时，大部分细胞具有典型神经元样形态:较多的神经元样细胞聚集在一起，相邻细胞间的轴突联结成网状。 3.对照组rMSCs(未诱导rMSCS)仅表达少量nestin和NSE，阳性率分别为1.8%士0.8%和5.6%士2.9%。实验组rMSCs诱导lh、3h后nestin阳性率分别为40.2%士3，3%和27.0%士2.9%，nestin的表达呈现先上升后下降的趋势(P<0.05);郑州大学2()()4届硕卜研究生学位论文大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经细胞分化及神经节昔脂对神经元样细胞的影响实验组诱导sh后NSE的阳性率为78.8%士3.0%，与对照组差异有显著性(P<0.05);GFAP的阳性率为8.6%士1.8%。 4.分化的神经样细胞培养24h后，高、中剂量GMI在，NSE表达阳性率分别为75.6%士2.7%和69.6%士3.4%，平状或类似星状，NSE表达为阴性。至48h时，高、中齐性(尸<0 .05);中、高剂量GMI组间差异亦有显著性(尸<0.05)。 结论: 1.成年rMSCS可以在体外培养扩增; 2.rMSCs经体外定向诱导后，可以分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞; 3.GMI对MSCs分化的神经元样细胞具有保护作用，有利于分化神经细胞的培养。