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中药土鳖虫(Eupolyphaga steleophaga),为鳖蠊科(Corydzi-Zidae)昆虫地鳖(EEupolypha gasinensi Walker)或冀地鳖(Steleophaga plancyi Boleny)雌虫干燥体,具有通经活络、行疲破血、消肿化积等功效。其化学成分复杂,药理作用广泛,具有深入挖掘价值。随着科技深化发展,土鳖虫应用领域逐渐扩大,药理作用研究日趋深入。大量研究和临床结果表明,土鳖虫具有抑制癌细胞、调节脂质代谢和消除自由基等功效,可治疗和预防多种疾病。通过进一步对土鳖虫深入研究,有利于揭示土鳖虫药物作用途径和相关机制,为全面发挥其治疗作用提供理论基础和研究导向。高胆固醇血症(hypercholesterolaemia)属于一种血脂异常病,指血清总胆固醇水平(TC)高于正常值,该病易导致外周血管类疾病,诱发心肌梗死、中风和脑卒中,严重危害人类健康,对该病预防和治疗应保持高度重视。兔为高胆固醇血症相关研究理想模式动物之一,对胆固醇敏感等生理特点有利于短期内建立稳定研究模型,不仅有助于人类对高胆固醇血症药理和病理研究,更可促进研究结果转化。目前,防治高胆固醇血症药物主要为西药,多为单靶点作用,并且副作用较强。土鳖虫抗胆固醇作用具有作用多靶点、不良反应小等优势,相关研究日益增多。本研究以60只二月龄雄性哈尔滨大白兔(Leporidae)为实验动物,通过饲喂富含胆固醇饲料8周制备高胆固醇血症兔。造模完成后,高胆固醇血症兔被随机分为3组,对照组11只,高、低剂量治疗组各12只。高、低剂量治疗组分别饲喂含有0.4 g/kg和0.2 g/kg 土鳖虫粉基础饲料,空白、对照组饲喂普通基础饲料,治疗期6周。通过检测不同组别兔血清胆固醇(TC)水平确定模型建立;使用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder五种算法评估9个常用内参基因在模型兔肾上腺、肝脏、脾脏和肾脏表达稳定性,获得最适内参基因,以提高qPCR结果准确性;分别应用荧光定量PCR和Western-blot方法研究各组兔肝脏LDLR、LXRα、ABCA1、SREBP-2、HMGCR、FXRα和CYP7A1七个基因在转录和翻译水平表达变化,以探讨土鳖虫抗高胆固醇血症机制;检测血清AST、ALT和AST/ALT水平,评价高、低剂量土鳖虫对肝损伤指标影响。主要研究结果如下:1)高胆固醇血症兔造模结束时,高胆固醇血症兔组TC水平显著高于空白组(P<0.01),表明哈白兔可制备高胆固醇血症兔;治疗结束时,对照组TC水平显著高于空白组和高、低剂量给药组(P<0.01),高、低剂量给药组间无差异显著性(P>0.05),表明2种剂量土鳖虫均可调节高胆固醇血症兔血清胆固醇,且治疗效果相似。2)土鳖虫抗哈白兔高胆固醇血症模型中,GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder五种算法综合评估9个常用内参基因在四种不同组织表达稳定性结果如下,肾上腺中4个较稳定内参基因为:Hprt1、B2m、Actb和Eefla1,2个最不稳定内参基因为:Gapdh和Sdha,最适内参基因为Hprt1(GM=1.968)和B2m(GM=2.968);肝脏中4个较稳定内参基因为:Gapdh、B2m、Ywhaz和Eeflaz,3个最不稳定内参基因为:Hprt1、Actb和Rpl5,最适内参基因为:Gapdh(GM=2.236)和B2m(GM=2.449);脾脏中4个较稳定内参基因为Gapdh、Ywtaz、Rpl5和Sdha,2个最不稳定内参基因为Eefla1和Actb,最适内参基因为Gapdh(GM=2.060)和Ywhaz(GM=2.340);肾脏中4个较稳定内参基因为Ppia、B2m、Gapdh和Actb,2个最不稳定内参基因为:Rpl5和Eefla1,最适内参基因为Ppia(GM=1.968)、B2m(GM=2.060)和Gapdh(GM=2.449)。3)以Gapdh、B2m和Actb为内参基因,标准化Pary1基因在肝脏中表达,结果表明,Gapdh作为内参基因,空白组、对照组和高、低剂量给药组间相对表达比率差异不大;B2m作为内参基因,各组间相对表达比率略有差异;Actb作为内参基因,各组间相对表达比率变化较大,Gapdh和B2m较Actb更适合为模型内参基因。4)治疗结束时,结果显示,高、低剂量给药组比较于对照组LDLR基因在转录和翻译水平表达显著上调(P<0.05),表明土鳖虫可提升LDLR基因表达,促进LDL吸收。与对照组比较,高、低剂量给药组LXRα在转录和翻译水平表达显著上调(P<0.05),高剂量给药组ABCA1基因转录和翻译水平表达显著上调(P<0.05),低剂量组ABCA1转录水平表达显著上调(P<0.05),翻译水平表达无显著差异(P>0.05),表明土鳖虫可加速肝细胞胆固醇外排,降低肝细胞内胆固醇水平,高剂量作用效果更显著。与对照组比较,高剂量给药组SREBP-2转录和翻译水平表达显著下调(P<0.05),低剂量给药组SREBP-2转录水平表达无显著差异(P>0.05),翻译水平表达显著下调(P<0.05),高、低剂量给药组HAGCR转录和翻译水平表达显著下调(P<0.05),表明土鳖虫可影响胆固醇合成途径降低胆固醇合成,高剂量作用效果更突出。与对照组比较,高剂量给药组FXR在转录和翻译水平表达显著下调(P<0.05),低剂量给药组FXRα在转录水平表达显著下调(P<0.05),翻译水平表达无显著差异(P>0.05),高、低剂量治疗组CYP7A1在转录和翻译水平表达显著上调(P<0.05),表明土鳖虫可促进胆固醇合成为胆汁酸,调节胆固醇平衡。5)治疗结束时,AST、ALT和AST/ALT在各处理组间差异不显著(P>0.05),表明高、低剂量土鳖虫未导致肝损伤指标提升。本研究以高胆固醇血症兔模型为出发点,建立土鳖虫抗哈白兔高胆固醇血症模型,依据模型特点,使用特定算法获得模型肝、脾、肾和肾上腺最适内参基因,应用最适内参基因标准化固醇代谢相关基因,旨在应用分子生物学技术探索土鳖虫调节胆固醇机制,对深化药理研究,充分发挥药效具有重要意义。本研究具有以下创新点:1)应用 GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt 和 RefFinder 五种算法综合评估 9 个候选内参基因在模型兔肝、脾、肾和肾上腺表达稳定性,获得4种组织最适内参基因,提高qPCR结果准确性。2)研究土鳖虫对胆固醇吸收途径:LDLR,外排途径:LXRα、ABCA1,合成途径:SREBP-2、HMGCR和转化途径:FXRα、CYP7A1基因转录和翻译水平表达影响,分析探讨土鳖虫发挥功效目标基因,从分子水平探究土鳖虫抗胆固醇多靶点效应,揭示土鳖虫抗胆固醇作用机制。依据实验结果得到如下结论:1)综合GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder五种算法结果可提高内参基因评估结果准确性。2)本实验模型中最适内参基因,肾上腺中为Hprt1和B2m;肝中为Gapdh和B2ni;脾中为Gapdh和Ywhaz;肾中为Ppia、B2/m和Gapdh,可提高应用荧光定量PCR技术分析土鳖虫药理作用相关基因表达结果准确性。3)土鳖虫多靶点抗高胆固醇血症机制可能与调节如下基因表达有关:上调LDLR基因转录和翻译表达,提高胆固醇吸收;上调LXRα、ABCA1基因转录和翻译表达,促进胆固醇外排;下调SREBP-2、HMGCR基因转录和翻译表达,减少胆固醇体内合成;下调FXRα基因转录和翻译表达,上调CYP7A1基因转录和表达,促进胆固醇转化。