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目的: 探讨火针疗法对SCI模型大鼠神经功能恢复、内源性神经干细胞增殖、神经元分化及Wnt/ERK多信号途径相关蛋白及其mRNA的影响,部分阐释火针疗法调控SCI后脊髓神经修复效应及机制,为火针治疗SCI及其并发症提供科学理论依据。 方法: 本研究选用SD成年雌鼠,随机分为空白组、假手术组、模型组和火针组,其中模型组和火针组各取1d、3d、7d、10d、14d五个时间点。采用改良的Allens法制备SCI模型,假手术组只做T9、Tl0椎板切除术;模型组造模后不予干预;火针组每日用火针点刺T7-T8、T11-T12棘突下两侧的华佗夹脊穴,以快针法针刺。通过BBB评分观察火针疗法对SCI大鼠神经功能恢复的影响;应用尼氏染色观察火针疗法对SCI大鼠损伤局部脊髓神经元的影响;采用Western blot和RT-PCR检测nestin、β-Tubulin III蛋白及mRNA表达,观察火针疗法对内源性神经干细胞增殖及神经元分化的影响;通过Western blot和RT-PCR检测Wnt3a、β-catenin、GSK3β、MEK、ERK1蛋白及mRNA表达,观察火针疗法对Wnt/ERK多信号途径的影响。 结果: 1.对神经功能的影响 BBB评分结果显示,术前所有实验动物双后肢评分均为21分,术后1d评分为0,证明造模成功,术后3d,各组大鼠后肢功能开始恢复,但火针组分值与模型组相当,从术后7d开始,火针组与模型组评分结果均逐渐升高,并持续到术后14d,但火针组评分均高于模型组,在10d、14d火针组评分与模型组比较差异具统计学意义(P<0.05)。 2.对神经细胞形态的影响 尼氏染色结果显示,损伤1d,模型组和火针组大鼠神经细胞尼氏体的形态呈现出不规则改变,数目减少,染色较浅,但火针组损伤程度优于模型组,两组比较差异具统计学意义(P<0.05);治疗3d、7d,两组大鼠尼氏体形态逐渐好转,数目逐渐增多,但两组间差异无统计学意义。治疗10d、14d,火针组尼氏体数目逐渐增多,形态恢复正常,染色逐步加深,显著优于模型组,差异具统计学意义(P<0.05)。 3.对eNSCs增殖分化的影响 RT-PCR及Western blot实验结果显示,模型组和火针组Nestin mRNA及蛋白表达呈先增后降趋势,分别在7d或3d达高峰,火针组的总体表达优于模型组,且火针组在1d,3d时mRNA表达量均明显高于模型组(P<0.05),在1d时蛋白表达明显高于模型组(P<0.05)。 模型组和火针组β-Tubulin III mRNA表达呈先增后降趋势,模型组出现双峰(3d、10d),火针组在7d达高峰,火针组在1d、7d、14d时β-Tubulin III mRNA表达均明显高于模型组(P<0.05);模型组大鼠β-Tubulin III蛋白表达量较空白组与假手术组明显减少,3d升高后在7d有所下降,10d、14d又逐渐升高;火针组β-Tubulin III蛋白表达在1d、3d持续降低,7d、10d逐渐升高,14d下降趋于平缓;且火针组在7d、10d时β-Tubulin III蛋白表达均明显高于模型组(P<0.05)。 4.对Wnt/ERK多信号途径的影响 (1)对Wnt/β-catenin信号通路的影响 RT-PCR及Western blot实验结果显示, 脊髓损伤1d,模型组和火针组Wnt3a mRNA表达量与空白组及假手术组比较明显升高,模型组优于火针组,差异有统计学意义(P<0.05);随后两组均呈先增后降趋势,7d达高峰,此时火针组明显优于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);1d,Wnt3a蛋白的表达量均降低,且随时间变化呈双峰趋势,模型组7d表达量最低,10d表达量最高,火针组3d表达量最低,10d表达量最高,火针组整体增高趋势优于模型组。 模型组β-catenin mRNA的表达量总体呈增高趋势,在7d达高峰;火针组各时相间呈先增后降,3d达高峰,1d、3d、7d、10d表达量均高于模型组,差异具统计学意义(P<0.05)。1d,模型组和火针组β-catenin蛋白表达量均升高,模型组各时相间呈双峰趋势,分别在3d、10d出现高峰;火针组3d表达量较1d低,后增加,至10d出现高峰;火针组在1d、7d的蛋白表达量均明显优于模型组(P<0.05)。 脊髓损伤1d,模型组GSK3βmRNA表达量与空白组和假手术组比较差异不大,火针组明显增加;两组的mRNA表达量在各时相间均呈先增后减,模型组在7d时达高峰,火针组在3d时达高峰;在1d、3d、7d、10d,火针组的表达量显著优于模型组(P<0.05)。模型组和火针组的GSK3β蛋白表达量均比空白组和假手术组增多;两组各时相间均呈双峰趋势,均在3d、10d达高峰;1d时,火针组的蛋白表达量显著优于模型组(P<0.05);其余各时相间差异不大。 (2)对ERK1/2信号通路的影响 RT-PCR及Western blot实验结果显示, 脊髓损伤后,模型组与火针组MEK mRNA表达量均升高,模型组表达量1-10d逐渐升高,10d达高峰,14d缓慢下降;火针组1d、3d逐渐升高,7d降低,10d、14d缓慢升高;7d、10d火针组表达量均显著低于模型组(P<0.05)。脊髓损伤后,模型组和火针组MEK蛋白表达均升高,两组均在3d达高峰,后逐渐降低,火针组降低更明显;在10d、14d火针组表达量显著低于模型组(P<0.05)。 1d,模型组和火针组大鼠ERK1 mRNA表达量较空白组与假手术组显著增多;模型组和火针组ERK1 mRNA表达随时间逐渐降低,在1d、3d、7d和10d,火针组ERK1 mRNA表达量明显低于模型组(P<0.05)。模型组与火针组大鼠ERK1蛋白表达量较空白组与假手术组显著增多;模型组蛋白表达量在1d、3d、7d逐渐减少,10d有所升高,14d又降低;火针组蛋白表达量在随时间逐渐降低;在1d、3d、10d和14d,火针组ERK1蛋白表达量明显低于模型组(P<0.05)。 结论: 1.火针疗法可有效保护SCI大鼠损伤局部神经元,改善大鼠后肢运动功能,促进大鼠神经功能恢复。 2.火针疗法可通过调控Wnt/ERK多信号途径促进内源性神经干细胞增殖及向神经元分化,发挥神经修复作用。