论文部分内容阅读
目的: 本研究在已知lncRNA-SENCR对平滑肌细胞功能影响的基础上，探讨其在血管内皮细胞中的功能。研究结果对揭示CNV形成的分子基础，阐明其病理生理学机制具有十分重要意义。同时，本项研究有着重要的转化医学意义，lncRNA-SENCR有可能成为今后治疗视网膜新生血管的又一靶点，为眼底病的防治新策略提供个性化治疗的理论基础。 方法: 1、细胞培养 2、细胞转染、。 3、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR) 4、Arraystar对长链非编码RNA进行测序 5、荧光原位杂交(RNA-FISH)观察长链非编码RNA-SENCR在细胞中的位置 6、细胞划痕实验 7、细胞增殖实验 8、血管管腔形成实验 9、纤维细胞与血管内皮细胞共培养实验 结果: 1、长链非编码RNA在不同细胞中的测序结果:利用Arraystar Human LncRNA array(Version2.0)对五种细胞系提取的RNA分别进行测序。热图显示出与2种非内皮细胞相比其他3种内皮细胞中富含的排名前50的长链非编码RNA。圆图显示内皮细胞中比非内皮细胞高2倍的长链非编码RNA类型，按照lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，该测序包括62个正义，83个反义，23个双向，22个内含子，308个基因间隔区。 2、长链非编码RNA-SENCR的结构及其在不同细胞中的表达:利用RT-qPCR方法检测长链非编码RNA-SENCR在不同细胞中的表达。与非内皮细胞组相比，内皮细胞组的SENCR含量显著高于非内皮细胞组(p＜0.005)。SENCR由3个外显子组成，与编码基因FLI1为反义转录方向。 3、荧光原位杂交观察长链非编码RNA-SENCR在细胞中的位置:利用荧光原位杂交RNA-FISH观察到了少量的SENCR表达在HUVEC细胞的细胞核及胞浆中。 4、RT-qPCR检测DsRNA下调SENCR的效率:瞬时转染10nM的DsRNAi-control，DsRNA3，DsRNA5至HUVEC细胞中，利用RT-qPCR观察该DsRNA对长链非编码RNA-SENCR下调的效率。与转染DsRNAi-control的对照组相比，DsRNA3,DsRNA5均可以显著下调SENCR（***p＜0.005）。 5、长链非编码RNA-SENCR对新生血管的调控作用: (1)细胞划痕实验检测SENCR对内皮细胞迁移的影响:在生长因子VEGF的作用下，与对照组DsRNAi-control相比，转染DsRNA3，DsRNA5的两组细胞在细胞划痕12小时后迁移明显加快。 (2)细胞增殖实验(Brdu)检测SENCR对内皮细胞增殖的影响:与对照组DsRNAi-control相比，下调长链非编码RNA-SENCR可以使细胞增殖显著增加。 (3)管腔形成实验检测SENCR对内皮细胞增殖的影响:与对照组DsRNAi-control相比，下调长链非编码RNA-SENCR细胞形成管腔分支显著增加（**p＜0.01）。 (4)纤维细胞与内皮细胞共培养检测SENCR对内皮细胞的影响:与对照组DsRNAi-control相比，下调长链非编码RNA-SENCR细胞形成三维血管腔显著增加（***p＜0.005）。 6、下调长链非编码RNA-SENCR对靶基因的作用:转染dsRNA下调长链非编码RNA-SENCR，与新生血管相关的基因均显著上调（***p＜0.005）即呈负相关。 7、长链非编码RNA-SENCR与靶基因MDK的相互作用: (1)转染SiMDK对长链非编码RNA的作用:转染SiRNA干扰MDK的表达可以显著下调MDK的量，同时显著上调长链非编码RNA-SENCR的表达，即MDK与SENCR表达呈负相关。 (2)纤维细胞与内皮细胞共培养检测SiMDK对内皮细胞的影响:通过转染SiRNA下调MDK，观察其对共培养的细胞的影响。Si-MDK可以显著减少血管生成（***p＜0.005）。 (3)RT-qPCR检测DsRNA及SiRNA的共转染效率:DsRNA可以显著下调SENCR的表达，上调MDK;SiRNA可以显著上调SENCR的表达，下调MDK;SiRNA可以恢复Ds-SENCR3对SENCR的下调，但是对于Ds-SENCR5处理的样品却没有此功能。 (4)细胞划痕实验检测DsRNA/SiRNA共转染对内皮细胞迁移的影响:转染DsRNA3细胞迁移速率显著加快（***p＜0.005）;共转染DsRNA3/Si-MDK组细胞迁移率显著减慢（***p＜0.005）。 (5)DsRNA/SiRNA共转染对纤维细胞与内皮细胞共培养的影响:转染DsRNA3，血管生成显著增加（***p＜0.005）;共转染DsRNA3/Si-MDK血管生成显著减少（***p＜0.005）。 结论: 1、SENCR由3个外显子组成，与编码基因FLI1为反义转录方向。长链非编码RNA-SENCR在内皮细胞中表达明显高于其他细胞。 2、SENCR在细胞核和细胞质中均有表达。 3、转染DsRNA可以显著下调SENCR的表达，加快细胞迁移速率，增加细胞增殖速率，加快新生血管的形成。 4、下调SENCR可以导致靶基因MDK上调;转染SiMDK可以显著下调MDK，上调SENCR，使细胞迁移率减慢，新生血管减少。 5、长链非编码RNA-SENCR在新生血管的发病过程中发挥重要作用，可能成为湿性老年性黄斑病变诊断和治疗中一种新的生物学标记或药物新靶点。