β-甘露聚糖酶高产菌株的选育及其固定化细胞产酶条件优化

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β-甘露聚糖酶(β-mannanase)的研究及应用一直是人们关注的热点。筛选出β-甘露聚糖酶高产菌株并将其应用于生产实践具有重要意义。本文即是通过诱变育种技术的使用,筛选获得一株β-甘露聚糖酶高产菌株,并通过菌体固定化技术等手段,确定了该菌株应用于生产实践的可能性。该研究为β-甘露聚糖酶的生产奠定了菌株基础。本文首先选取紫外线、氦氖激光和亚硝基胍依次对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)HDYM-04进行诱变。以β-甘露聚糖酶酶活力为检测指标,结果表明,紫外线的最佳诱变剂量为照射距离50cm,照射时间10s,筛选出的高产突变株U2-12的β-甘露聚糖酶酶活为1103±32.19 U/mL,较出发菌株(酶活为322.33±9.88 U/mL)高出241.84%;氦氖激光的最佳诱变剂量为照射距离5 cm,照射时间30 min,筛选出的高产突变株N2-10的β-甘露聚糖酶为1204.33±18.61 U/mL,较出发菌株(酶活为322.33±9.88 U/mL)高出273.63%;较U2-12高出1 0.52%;亚硝基胍的最佳诱变剂量为亚硝基胍浓度3 mg/mL,作用时间16 min,筛选出的高产突变株G2-3的β-甘露聚糖酶酶活为1259.33±39.37 U/mL,较出发菌株(酶活为322.33±9.88 U/mL)高出290.70%;较U2-12高出 14.17%;较N2-10高出9.86%。为了提高高产突变株G2-3的发酵能力,本文继续对该菌株进行发酵条件的优化,在确定各单因素对菌株生产β-甘露聚糖酶的影响后,采用正交设计试验确定各单因素的最佳组合。结果表明:当培养温度为36℃,接种量为2%,魔芋粉加入量为]%,初始pH值7.0,摇床转速150 r/min时,G2-3代谢产生的β-甘露聚糖酶酶活为1579.58±59.41 U/mL,较未优化前提高了32.91%。为了从分子角度明确诱变对出发菌株碱基序列和氨基酸序列的影响,探索β-甘露聚糖酶基因序列中与酶活变化相关的位点,本文对地衣芽孢杆菌HDYM-04及诱变后各菌株,包括高产突变株U2-12、N2-10、G2-3,低产突变株U1-36、N1-41、G1-10,β-甘露聚糖酶基因进行克隆并测序,利用bioedit软件分析比对了这些菌株序列的差别,结果显示,高产突变株具有5个突变热点,低产突变株具有9个突变热点,活性变化位点在β-甘露聚糖酶基因1~13 bp、16~18 bp、30 bp、187 bp、202~203 bp、213 bp、226~227 bp、255~256bp、264~265 bp、301 bp和471 bp处。31~202 bp和302~444 bp为地衣芽胞杆菌HDYM-04 甘露聚糖酶基因保守区。由于β-甘露聚糖酶可以应用到饲料生产、染料脱色等实际生产中,为了适应生产实际,本文还探索了利用固定化技术在该酶生产中的可行性。首先从海藻酸钠法、聚乙烯醇法、卡拉胶法这三种固定化方法中,确定最佳固定化方法为聚乙烯醇法。并对该固定化方法进行条件优化,,确定当聚乙烯醇浓度为2%,菌体浓度为1:1时,最高β-甘露聚糖酶酶活保留率可以达到41.93±0.90%,比初始固定化菌体提高了 1 8.60%。对优化后的固定化菌体进行最佳发酵条件的研究表明,当魔芋粉加入量为0.7%,最佳接种量为1%,最佳增殖时间60 h时,固定化菌体的β-甘露聚糖酶酶活最高,为838.96±25.79 U/mL,利用该条件下制备的菌球进行发酵32h,可以使酶活达到962.37±15.61 U/mL。并且该菌体可以重复使用6次,酶活不变。由于β-甘露聚糖酶对染料具有脱色作用,所以为了探讨染料的可用范围及能力,本文选择32种染料进行试验,包括菁系,蒽醌类,偶氮类,三芳甲烷类,三芳甲基类和杂环类染料。结果显示,β-甘露聚糖酶对于三芳甲烷类染料具有较强的脱色能力,其中染料苯胺蓝、水溶苯胺蓝的脱色率在24 h时可达到70%以上;孔雀石绿在12 h时就可达到49.14%,24 h后可达到83.02%;苯酚红在脱色反应24 h后可以达到95.97%。总之,本研究通过对试验菌株的诱变选育和固定化方法及条件的优化,提高了菌种生产β-甘露聚糖酶的能力,并探讨了酶活变化的分子原理,及对染料脱色的可能性。这为该菌株进一步应用于生产奠定了坚实的基础。
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