代谢组学作为系统生物学的重要分支,已经成为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的一个新的组学研究热点。它是通过考察生物体受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢物的变化或其随时间的变化,研究生物体系的代谢途径的一种技术。代谢组学提供了一种全面综合研究机体代谢网络变化的新理念,对于阐明生命复杂系统具有重要意义。糖尿病是由于胰岛素分泌绝对或相对不足而导致的一种全身代谢紊乱综合征,临床上的典型症状为高血糖。糖尿病的患病率正随着人们生活方式的改变和人口老龄化进程的加速呈现上升的趋势。它已经成为继肿瘤和心血管疾病之后威胁人类生命健康的第三大慢性非传染性疾病。Ⅱ型糖尿病患者约占总糖尿病患者的95%,Ⅱ型糖尿病的各种慢性并发症是导致糖尿病患者致残和致死率升高的主要原因。然而,临床上大多数Ⅱ型糖尿病患者在被确诊之前已伴有一种或几种并发症的发生。因此,全面了解糖尿病的发病机制,寻找可用于糖尿病早期发现和并发症诊断的标志物已经成为生命科学领域研究的热点问题。目前,关于降糖药作用机制的研究大多数是针对特定靶点进行的,没有反映药物对整个代谢网络的影响,未能系统地阐明药物作用机制。本课题借助1HNMR、UPLC／MS、HPLC／UV和GC／FID等多种现代分析技术,采用代谢组学的策略和方法从整体水平研究空腹葡萄糖异常患者(糖尿病前)和Ⅱ型糖尿病患者血清、尿液中代谢物的变化,通过化学统计学和生物信息学,挖掘出与Ⅱ型糖尿病发生、发展相关的生物标志物,为Ⅱ型糖尿病的早期诊断和发病机制的全面阐明提供科学依据。研究给予二甲双胍和磺酰脲类降糖药治疗后Ⅱ型糖尿病患者血清代谢物的变化,寻找与药物作用相关的生物标志物,全面构建药物对机体代谢影响的网络图,指导临床合理、安全用药及个体化治疗。一、人血清代谢组学研究的分析平台(1)建立了人血清代谢指纹分析的1HNMR方法。采用磷酸盐缓冲液对血清样品进行稀释；调用弛豫编辑脉冲序列(CPMG)进行数据采集。通过与文献比对鉴定了血清代谢指纹谱中的代谢物。(2)建立了人血清代谢指纹分析的UPLC／MS方法。采用沉淀蛋白法进行血清样品预处理；应用UPLC实现了血清中复杂组分的良好分离。采用二级质谱技术推断了血清代谢指纹谱中的20种代谢物。(3)建立了人血清氨基酸谱定量分析的HPLC／UV方法。采用丹磺酰氯对血清样品进行柱前衍生化处理；应用HPLC／UV技术成功地分离并定量测定了血清中17种氨基酸。(4)建立了人血清游离脂肪酸谱分析的GC／FID方法。采用硫酸-甲醇对血清样品进行甲酯化处理；应用GC／FID技术分离检测了血清中10种游离脂肪酸,并采用GC／MS技术对其进行了定性分析。(5)建立了人血清溶血磷脂酰胆碱靶标分析的UPLC／MS／MS方法。血清样品采用三氯甲烷-甲醇提取,在正离子模式下,采用多反应监测方式对三种溶血磷脂酰胆碱进行定量测定。所建立的人血清代谢指纹、代谢谱和代谢物靶标分析方法均经过方法验证,可用于代谢组学的研究。二、人尿液代谢组学研究的分析平台(1)建立了人尿液代谢指纹分析的UPLC／MS方法。尿液样品采用去离子水稀释；应用UPLC实现了对尿液中复杂组分的良好分离。采用二级质谱技术鉴定了尿液代谢指纹谱中的18种代谢物。(2)建立了人尿液代谢指纹分析的GC／FID方法。采用氯甲酸乙酯对尿液样品进行衍生化处理；应用HP-5毛细管气相色谱柱实现了尿液组分的良好分离。采用对照品比对鉴定了尿液代谢指纹谱中的13种代谢物。所建立的人尿液代谢指纹分析的UPLC／MS和GC／FID方法经过方法验证,可用于代谢组学的研究。三、人尿液代谢组学分析平台用于Ⅱ型糖尿病发病机制和诊断研究将建立的人尿液代谢组学分析平台用于Ⅱ型糖尿病发病机制和诊断研究发现：(1)正常人、空腹葡萄糖异常患者和Ⅱ型糖尿病患者尿液代谢指纹谱有明显的差别。(2)空腹葡萄糖异常患者的尿液代谢指纹谱介于正常人与Ⅱ型糖尿病患者之间。(3)与正常人相比,空腹葡萄糖异常患者尿液中甲酚硫酸盐、谷氨酸、天冬氨酸浓度增加,马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、肌酸酐、柠檬酸、色氨酸、壬二酸浓度降低。Ⅱ型糖尿病患者尿液中甲酚硫酸盐、肉毒碱、谷氨酸、天冬氨酸和棕榈酸浓度显著高于正常人,马尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、肌酸酐、柠檬酸、色氨酸、壬二酸浓度显著降低,且色氨酸和壬二酸浓度降低的程度大于空腹葡萄糖异常患者。尿液中这些代谢物浓度的变化提示Ⅱ型糖尿病患者体内存在氨基酸代谢、能量代谢、肠道菌群代谢和脂肪酸氧化等途径的异常。(4)采用受试者工作特征曲线(ROC)评价潜在生物标志物用于Ⅱ型糖尿病诊断的准确性,发现尿液中肌酸酐、苯乙酰符氨酰胺和谷氨酸能及早提示糖尿病发生的可能性。尿液中谷氨酸、天冬氨酸、色氨酸、马尿酸、肌酸酐、肉毒碱C8：1、壬二酸和苯乙酰谷氨酰胺在Ⅱ型糖尿病的临床诊断中具有应用价值。四、人血清代谢组学分析平台用于Ⅱ型糖尿病发病机制和诊断研究将建立的人血清代谢指纹分析、人血清氨基酸、游离脂肪酸谱分析和人血清溶血磷脂酰胆碱靶标分析方法用于Ⅱ型糖尿病发病机制和诊断研究发现：(1)1HNMR测得的正常人和Ⅱ型糖尿病患者血清代谢指纹谱实现了明显的分离；UPLC／MS测得的正常人、空腹葡萄糖异常和Ⅱ型糖尿病患者血清代谢指纹谱和HPLC／UV测得的氨基酸谱、GC／FID测得的游离脂肪酸谱均实现了明显的分离。(2)空腹葡萄糖异常患者的血清代谢指纹谱、氨基酸谱和游离脂肪酸谱都介于正常人和Ⅱ型糖尿病患者之间。(3)与正常人相比,空腹葡萄糖异常患者血清中溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、十六烯酸、十八烷酸、十八烯酸和十八二烯酸浓度增加,花生四烯酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸和胱氨酸浓度降低。Ⅱ型糖尿病患者血清中溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、脂蛋白、乳酸、N-乙酰化糖蛋白、乙酰乙酸、不饱和脂、十四烷酸、十六烷酸、十六烯酸、十八烷酸、十八烯酸和十八二烯酸代谢物浓度增加,丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、甘氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、胱氨酸、花生四烯酸、柠檬酸、肌酸酐、组氨酸和甲酸盐浓度降低。血清中这些代谢物浓度的变化提示Ⅱ型糖尿病患者体内除存在糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢的紊乱外,还存在氧化应激、能量代谢、肠道菌群代谢的异常。(4)血清中(16：0／0：0)溶血磷脂酰胆碱、天冬氨酸、苯丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、十六烯酸、十八烷酸、十八烯酸和十八二烯酸能及早提示糖尿病发生的可能性。血清中溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、脂蛋白、柠檬酸、肌酸酐、不饱和脂、天冬氨酸、组氨酸、甲酸盐、苏氨酸、甘氨酸、胱氨酸、十四烷酸、十六烷酸、十六烯酸、十八烷酸、十八烯酸、十八二烯酸、N-乙酰化糖蛋白和花生四烯酸在Ⅱ型糖尿病的临床诊断中具有应用价值。(5)对血清中三种溶血磷脂酰胆碱标志物进行定量测定,发现血清中(16：0／0：0)溶血磷脂酰胆碱在糖尿病前期诊断中的灵敏度为63%,特异度为95%。五、人血清代谢组学分析平台用于Ⅱ型糖尿病治疗机制研究将建立的人血清代谢指纹分析和人血清氨基酸、游离脂肪酸谱分析方法用于Ⅱ型糖尿病治疗机制研究,发现：(1)给予二甲双胍和磺酰脲类降糖药治疗后的Ⅱ型糖尿病患者血清代谢指纹谱、氨基酸谱和游离脂肪酸谱都与未经治疗的Ⅱ型糖尿病患者有明显差别。(2)与未经治疗的Ⅱ型糖尿病患者相比,给予二甲双胍治疗后的Ⅱ型糖尿病患者血清中溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、十六烷酸、十八烷酸、十八烯酸、十八二烯酸、脂蛋白和乳酸浓度降低；3-羟基丁酸、柠檬酸、肌酸酐、N-氧化三甲胺、甲酸盐、组氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和胱氨酸浓度升高。给予磺酰脲类降糖药治疗后的患者血清中溶血磷脂酰胆碱、苯丙氨酸、十四烷酸、十八烷酸、十八烯酸和十八二烯酸浓度降低；花生四烯酸、磷脂酰胆碱、天冬氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸和胱氨酸浓度升高。(3)将建立的人血清代谢组学分析平台用于Ⅱ型糖尿病治疗机制研究发现二甲双胍和磺酰脲类降糖药都具有减弱氧化应激、抑制肝糖异生和脂肪分解的作用,同时二甲双胍还对肠道菌群代谢有一定的改善作用。