癌症已成为威胁人类健康的重大疾病。据GLOBOCAN2012最新统计数据显示,每年有1410万的癌症新发病例和820万的癌症死亡病例。而据最新《2013中国卫生统计年鉴》数据显示,癌症仍是国内首位致死病因,其死亡专率为164.51/10万。癌症的死因主要归咎于肿瘤侵袭和转移,这是肿瘤生物学行为的两大基本特征,但其侵袭和转移机制现仍不清楚。近年来,肿瘤学界已共同认识到癌症是整个躯体不平衡的一种表现,该理论的根本变化揭示了在研究肿瘤时,不仅要关注癌细胞本身,还要关注肿瘤微环境。在肿瘤进展过程中,肿瘤微环境与癌细胞共同演变,最终推动肿瘤侵袭转移。肿瘤微环境相当复杂,在肿瘤进展过程中发生实时动态的改变,因此如何从该原位环境中获取空间特征和分子信息,并进一步对上述信息开展定位、定性、定量及多维整合分析,是目前的现实难题。量子点,以其独特的尺寸和表面效应,展现出大小和组分可调的发射波长,激发光谱宽,发射光谱窄,荧光强度高,抗光漂白性好等优势,使其在生物医学的应用中显示出巨大的潜力,尤其是在多色成像方面。此外,结合多光谱分析系统和计算机辅助图像处理技术等的优势,构建基于上述成像和分析系统的新研究平台,以实现从形态学和统计学等多角度挖掘癌细胞-肿瘤微环境协同进化的多维信息。考虑到目前肿瘤临床困境,针对肿瘤微环境在肿瘤侵袭转移过程中的作用这一关键科学问题,充分发挥本单位在量子点标记分子探针技术应用领域的技术基础优势,本研究旨在开发一个新的研究平台,从癌细胞和肿瘤微环境两方面探索肿瘤侵袭和转移的机理。我们首先建立了基于量子点标记分子探针原位多色实时成像的标准化流程；其次,结合多光谱图像分析系统,进一步分析结构层面的癌细胞和肿瘤微环境的形态学和时空信息；然后,在计算机辅助图像处理技术的帮助下,获取定量和统计学信息,进一步探讨癌细胞和肿瘤微环境协同进化对患者预后的评估效能。因此,本研究一方面发展了肿瘤微环境理论,另一方面提出了癌细胞联合肿瘤微环境多种关键成分特征作为肿瘤预后指标的发展方向及相关综合分析策略,为进一步拓展肿瘤侵袭转移研究奠定基础,促进基础成果的临床转化。本研究主要包括以下三个部分：第一部分：基于量子点标记分子探针技术的肿瘤三维培养模型研究目的：建立肝癌细胞体外三维培养模型,模拟在体肿瘤微环境,在体外研究肝癌细胞侵袭转移的生物学行为特点。方法：基于Matrigel制作三维基质模型,跟踪观察不同培养时间的细胞形态,同时利用量子点标记分子探针实时监测HCCLM9勺形态学以及动力学特征。结果：在该三维培养模型中,HCCLM9细胞呈现出典型的肿瘤侵袭多步骤特征,包括：克服衰老,局灶性增生活跃,优势克隆侵袭。HCCLM9细胞在接种后不同时态,细胞及细胞间展现出不同形态,呈现出血管拟态及不规则克隆,同时伸出伪足,促进细胞变形,并向四周浸润生长,证明肝癌细胞具备自身变形能力。结论：本研究成功建立体外人肝癌细胞培养三维模型,模拟在体的肿瘤微环境。结合量子点标记分子探针的成像优势,可以更好得揭示肝癌细胞的生物学行为,证实肿瘤微环境间质成分在一定程度上影响癌细胞的生物学行为。第二部分：肿瘤侵袭转移过程中Ⅳ型胶原的动态变化目的：构建基于量子点标记分子探针的单分子成像标准化流程,探究Ⅳ型胶原在肿瘤侵袭转移过程中的动态改变,深化肿瘤微环境导向的肿瘤侵袭转移机理。方法：收集肝癌、胃癌、乳腺癌和宫颈癌的临床病理标本,利用免疫组化和量子点标记分子成像技术对癌细胞及其微环境中的关键分子进行成像,观察癌侵袭转移过程中Ⅳ型胶原的动态变化。结果：在癌侵袭转移过程中,Ⅳ型胶原呈现动态改变。首先在基底膜处交联增多,形成不规则且致密的袖套包裹癌巢；随后多处基底膜处的胶原发生构象改变并被降解形成侵袭前锋。同时,伴随着间质中的Ⅳ型胶原重新线性沉积,癌细胞最终逃逸转移。结论：癌侵袭转移过程中,Ⅳ型胶原在不同肿瘤中呈现共同的动态变化规律,为癌侵袭转移创造适宜的微环境。第三部分：基于量子点标记分子探针技术的癌细胞-肿瘤微环境协同进化目的：构建基于量子点标记分子探针的多分子成像标准化流程,并进一步探索癌细胞与肿瘤微环境关键成分巨噬细胞以及肿瘤新生血管的协同进化关系,深化对肿瘤侵袭转移过程中肿瘤微环境基本变化规律的认识,为进一步分析肿瘤微环境对患者预后的影响及指导临床治疗奠定理论基础。方法：回顾性收集宫颈癌和胃癌病例及其对应的主要临床病理信息。基于量子点标记分子探针技术,构建多分子成像标准化流程,借助多光谱分析系统以及计算机辅助图像处理技术,从形态学及统计学角度分析癌细胞与肿瘤微环境的协同进化作用。结果：以宫颈癌为鳞癌的代表和以胃癌作为腺癌代表的研究显示癌细胞和肿瘤微环境的共同协同进化规律。由正常组织到癌前病变至原位癌,最终进展至浸润型宫颈癌的过程中,肿瘤间质中关键成分巨噬细胞和肿瘤新生血管逐渐增多并且发生形态改变。统计学分析显示宫颈癌组织中的巨噬细胞密度(5540)比宫颈原位癌组织(2502)和宫颈癌旁组织(1403)都高,且组间差异有统计学意义(P=0.000,三组间)。血管密度的定量分析也有相似的结果,宫颈癌组织最多(27),其次是宫颈原位癌(17),癌旁组织中较少(6.5),三组间差异有统计学意义(P=0.000,三组间)。另外,胃癌的统计学数据分析显示低分化组的巨噬细胞密度(1544)显著高于高分化组(317)和印戒细胞癌组(1011)(P=0.001,三组间)。肿瘤新生血管的统计结果与肿瘤巨噬细胞的统计结果相似。低分化组的肿瘤新生血管密度最高(789),显著高于高分化组(474)和印戒细胞癌组(774)(P=0.029,三组间)。另外,将癌细胞、巨噬细胞和肿瘤新生血管作为整体考虑的肿瘤侵袭单元定量分析显示低分化组的肿瘤侵袭单元(373)显著高于低分化组(82)和印戒细胞癌组(177)(P=0.000,三组间)。其中巨噬细胞和肿瘤侵袭单元是胃癌的独立预后因子,且肿瘤侵袭单元(曲线下面积为63.2%)对胃癌患者的预后预测效能相较肿瘤新生血管和肿瘤巨噬细胞均高。结论：在肿瘤进展过程中,癌细胞和肿瘤微环境协同进化,肿瘤相关巨噬细胞和肿瘤侵袭单元可作为肿瘤的独立预后因素,联合肿瘤微环境特征有助于推动肿瘤预后预测并指导临床治疗。