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果胶酶是指能分解果胶质的一类酶。碱性果胶酶则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶,一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶。碱性果胶酶除了在植物病毒的纯化、纸浆漂白等方面得到应用以外,已成为棉织物预处理过程中至关重要的生物酶制剂。碱性果胶酶的使用将改变传统的碱精练工艺,不仅减少环境污染,节约大量的工艺用水,而且可提高棉纺织物的品质。
本文采用一株具有自主知识产权的枯草芽孢杆菌发酵生产碱性果胶酶,在前期实验室研究的基础上,研究了用价格低廉的合成氮源部分代替有机氮源以降低原料成本的可行性,并研究了补加碳源对产酶的影响;然后进行了将发酵法生产碱性果胶酶从7L罐放大到5M3的中试生产试验研究;最后研究了添加各种稳定剂和防腐剂以增强碱性果胶酶应用和保藏过程中的稳定性。主要研究结果如下:1、用硫酸铵代替部分有机氮源,可以较大幅度地降低培养基成本,替代后的培养基组成为:酵母膏2g/L,蛋白胨4g/L,硫酸铵4g/L,玉米淀粉8g/L,K2HPO4·3H2O9.2g/L,KH2PO43g/L,初始pH7.5。7L罐发酵产酶达28.32u/mL。
2、通过7L罐碱性果胶酶分批发酵试验发现,后期碳源不足是影响碱性果胶酶产量进一步提高的关键。但简单地增加初糖浓度仅促进菌体大量增长,而产酶并不能得到大幅度的提高;通过中期补加碳源发现,一次性补糖、分批补糖、恒速流加补糖酶活分别为37.61u/mL、49.16u/mL、48.51u/mL,比分批发酵产酶分别提高34%、75%、73%,从简化工艺考虑,分批补糖是适合碱性果胶酶发酵生产的方式。
3、在7L罐上确定了种子生长曲线,种龄为7~10h时,发酵生产碱性果胶酶的酶活较高,在工业化生产试验中则通过取样即时测定OD600的方法,选择OD600上升缓慢时进行种子液转接。
4、在理论计算的基础上结合生产实际,确定1M3种子罐的培养条件为:搅拌转速300r/min,通气量1vvm,罐压0.05MPa,温度37℃;5M3发酵罐的培养条件为:搅拌转速250r/min,通气量0.6vvm,罐压0.05MPa,温度37℃。
5、在5M3发酵罐中进行碱性果胶酶发酵生产试验,酶活在9h达到最高14.89u/mL,菌体干重至7h达到最大为8.6g/L。提取采用絮凝、板框过滤、超滤的工艺,最终产品酶活为117.7u/mL,总提取收率为79.7%。
6、研究了在碱性果胶酶酶液中添加糖类、多羟基醇类、金属离子、EDTA和其他一些化学物质对酶应用稳定性的影响,最终得到复合稳定剂配方为:乙酸钠6%、MgCl2·2H2O2%。
7、研究得到合适的碱性果胶酶的防腐剂配方为对羟基苯甲酸异丁酯0.4%。在酶液中加入对羟基苯甲酸异丁酯0.4%、乙酸钠6%和MgCl2·2H2O2%,该条件下,产品可在常温下保质三个月,酶活保留率达到91.67%,符合液体酶保藏标准。