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丙烯醛是一种活泼的α，β不饱和醛，也是一种典型的环境污染物。丙烯醛能直接与DNA发生反应，生成多种丙烯醛-DNA加合物，而这些加合物与吸烟相关的肺癌、阿兹海默病和一些心血病等密切相关。因而，准确测定人体内痕量的丙烯醛-DNA加合物是理解丙烯醛暴露和其毒理病理效应的关键。
高效液相色谱串联质谱方法(HPLC-MS/MS)具有灵敏度高、定量准确、操作安全等优点，已应用于丙烯醛-dG加合物(AcrdG)的检测中。在人体胎盘、肺组织、口腔组织和白细胞中都检测到AcrdG。尽管人体内，α-AcrdG含量低于γ-AcrdG，但其致突变性高于γ-AcrdG，因而α-AcrdG应引起更多的关注。此外，目前还不清楚人细胞内是否含有丙烯醛-dA加合物(AcrdA)和dC加合物(AcrdC)。这些非dG加合物的研究有助于我们更好解释丙烯醛的毒理效应。
本文首先阐述丙烯醛-DNA加合物的制备、纯化及鉴定过程，包括包括α-AcrdG、γ-AcrdG、AcrdA、AcrdC和相应的同位素加合物。利用这些标准品，发展了一种NH4HCO3增强的、稳定同位素稀释的超高效液相色谱串联质谱方法(UHPLC-MS/MS)，同时检测人白细胞内AcrdG、AcrdA和AcrdC。该方法的创新之处:以NH4HCO3作为流动相添加剂。与HCOOH、HCOONH4和CH3COONH4相比，NH4HCO3不仅提高了丙烯醛-dG加合物异构体的分离度，还能显著抑制ESI过程中金属复合物的生成，进而增加了丙烯醛-dG加合物的质子化效率，其质谱检测灵敏度提高了4.2倍（与HCOOH相比）。该方法中，丙烯醛-DNA加合物的检出限(LOD)在40-80 amol之间，这与纳流液相色谱-纳流电喷雾-串联质谱方法的灵敏度相当。尽管γ-AcrdG是所有样品中的主要加合物，但人白细胞样品也含有少量的α-AcrdG。此外，在所有的人白细胞样品中均检测到了Acr-dA，其含量非常接近于γ-AcrdG。在大部分样品中均可检测到AcrdC。这些数据表明在人体内存在这两种非dG加合物。
我们还发现NH4HCO3的增强效应同样适用于5-甲基胞嘧啶氧化产物的高灵敏分析中。哺乳动物体内Tet(ten eleven translocation)能氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)，生成5-羟甲基、5-醛甲基和5-羧甲基胞嘧啶（5hmC、5fC和5caC）。这三种氧化产物与DNA去甲基化密切相关，在细胞克隆、细胞核重新编程、胚胎发育等过程中起着重要的作用。然而，人细胞中5hmC含量比小鼠胚胎干细胞中5hmC含量低13倍，而比小鼠脑组织中5hmC低接近100倍，而5fC和5caC含量又比5hmC低100倍左右。因而，如何灵敏而准确定量人细胞内5-甲基胞嘧啶氧化产物（5hmC，5fC和5caC）仍是一个难题。
我们发展的NH4HCO3增强的、高灵敏的UHPLC-MS/MS方法，可应用于测定人细胞内5-甲基胞嘧啶氧化产物。与甲酸相比，NH4HCO3促使5hmC和5fC检测灵敏度提高了3-4倍。利用该方法，我们实现了四种培养的人细胞内痕量5hmC的准确定量。在A549、MRC5、293T和MCF-7细胞内，5hmC含量在20.5-281.9个/106C之间。
利用发展的高灵敏分析方法，我们进一步研究了一种重要营养物质（维生素C）与Tet的作用。体外氧化实验证明了维生素C能显著增强Tet酶活性，与对照相比，5hmC和5fC产率提高了3-6倍，其生成速率升高了5.1-7.1倍，而其它强还原剂并不能增强Tet的催化活性，这表明维生素C是Tet的独特辅助因子。荧光猝灭数据表明维生素C能与Tet非共价结合，其结合常数为8.7×103 M-1。维生素C处理后，野生型小鼠胚胎干细胞内5mC氧化产物生成量提高了2.7-26倍，同时5mC水平下降了13％-40％。维生素C不能引起Tet1和Tet2双敲除型小鼠胚胎干细胞内的5mC水平显著下降，而且5hmC含量远低于野生型处理组。这些数据表明维生素C通过Tet，促进小鼠胚胎干细胞内5mC氧化产物的生成和DNA去甲基化过程。在Tet转染的293T细胞内再次验证了这个结论。
GO(Gene ontology)和富集分析表明维生素C引起小鼠胚胎肝细胞内545个基因富集5hmC。这些基因与细胞分化、各种组织发育（包括脑、肌肉、心脏、血液、上皮等）、磷酸化、蛋白质合成和复合体组装、行为、转运、细胞周期和信号传导等功能密切相关。这些数据表明维生素C通过5hmC的生成，能够调控众多的生物功能。
选取同卵sfx/sfx小鼠作为模型动物，这种小鼠不能合成维生素C，只能通过食物摄取。维生素C摄入显著提高了小鼠肝脏、肺、脑组织中5hmC含量，明显降低了小鼠肝脏和脑组织中5mC含量。结果表明，维生素C能促进哺乳动物体内5mC氧化和DNA去甲基化过程。
本文建立了维生素C、Tet和DNA去甲基化之间的直接联系，具有重要的生物学意义。维生素C是人体必需的一种营养物，并普遍存在于各种组织，因而可以推测通过Tet，维生素C参与了细胞内DNA甲基化的动态调节过程，进而参与特定基因的转录调控中。这也更全面地解释一些维生素C的生物学功能，例如很可能与维生素C促进诱导的全能干细胞(iPSC)转化率有关。