目的:中药具有多成分、多靶点、多途径协同起效的临床作用特点。基于经典方药发现具有中药作用特点和独立自主知识产权的创新药物,是当前众多药学工作者孜孜以求的目标。中药复方的配伍原则和化药设计的结构拼合原理,二者均是将不同的药物单元,按照一定的法则有机组合,以期达到增效、减毒的目的。受此启发,本课题组前期基于中医经典药对“川苔—天麻”和“川考—丹参”中的代表性活性成分,运用拼合原理,分别开展了防治偏头痛和脑中风相关先导化合物的发现研究,并针对经方“十全大补丸”和“化 回生片”抗癌活性成分开展了抗肿瘤先导化合物的发现研究,经体外、体内系统的活性评价发现:所获得的先导化合物具有药对或复方的特征药理效应,效应强度明显强于前体原料,甚至与阳性对照药物相当,并体现出低毒的特点,相关成果已申请了国家发明专利和国际PCT专利。本研究旨在获得具有中药作用特点、自主知识产权的先导化合物。方法:本论文基于中医经典药对“川芎—丹参”、“川芎—当归”中代表性活性成分及其结构类似物,以拼合原理为指导,继续深入开展川芎嗪系列化合物的合成和活性表征相关工作;共设计川芎嗪—三萜类、川芎嗪—甾体类、川芎嗔—酚酸类化合物103个,实际合成中获得川芎嗔系列化合物108个,其中有91个化合物是在本课题开展中首次合成;综合采用神经细胞损伤模型(CoCl2致NGF诱导的PC12细胞损伤),肿瘤细胞相关模型,例如HT-29(人结肠癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、Be17402(人肝癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞),以及非癌细胞MDCK(犬肾上皮细胞)、3T3(小鼠胚胎细胞)、EHy926(人脐静脉内皮细胞)等9种细胞模型,评价川芎嗪化合物(108个)及其合成前体原料(14个)的活性和毒性,并通过系统的构效关系分析,基本阐释了川芎嗔系列化合物结构与活性之间的规律,为后期相关化合物的结构设计及活性筛选提供参考。结果:(一)抗肿瘤活性筛选,发现化合物4、13和26对已测试的癌细胞均具有显著的杀伤活性,半数有效抑制浓度(IC50)均<10 甚至部分样品的抑癌效果强于阳性对照药—顺铂(DDP,IC50≈5.5 μM),明显高于其前体合成原料的抗癌活性(IC50>20μM)。构效关系分析发现,川芎嗔—三萜类化合物和川芎嗔—甾体类化合物具有不同的构效规律,例如,在川芎嗔—甾体类化合物结构中适当增加川芎嗪基团的拼合比例,可以显著增加此类结构的抗癌活性,川芎嗪和甾体化合物的拼合比例对活性的影响顺序为3:1>2:1>1:1,但川芎嗔—三萜类化合物的抗癌活性规律与此相反,拼合比例为1:1时的活性优于2:1。毒性测试表明化合物4、13毒性较大,而化合物26仅能够温和的抑制人脐静脉内皮细胞Ehy926的生长,对正常细胞MDCK、3T3的生长影响较小(IC50>80 μM),在给药浓度在30 μM时完全不影响分化后的PC12细胞的生长,实验结果显示化合物26的细胞毒性与细胞分裂的强度成负相关,细胞分裂越强(癌细胞)其杀伤效果越明显,反之细胞分裂较弱(MDCK、3T3)其杀伤效果也减弱,对不分裂的细胞(NGF诱导后的PC12细胞)则完全没有杀伤活性,该样品具有药效明确、毒性较低、药理效应选择性强的特点;利用流式细胞仪技术开展作用机制研究发现,化合物4、13、26均可以在较低浓度(<8ΜM)下显著诱导HepG2细胞的凋亡,尤其是化合物26还可以影响HepG2细胞分裂周期,使细胞周期的G1/S分裂点发生阻滞,阻断细胞从G1期进入到S期,处于增殖状态的细胞相对减少,表明化合物26是通过诱导细胞凋亡和影响细胞分裂周期等多重途径来抑制HepG2细胞的增殖,这与中药多途径、多靶点的临床作用特点相似。鉴于此,本课题进一步优化化合物26的制备工艺,合成该样品约5.0 g(纯度>95%),开展化合物26的小鼠急性毒性试验和体内抗H22肿瘤研究,结果表明正常小鼠腹腔注射LD50>900 mg/kg。H22荷瘤小鼠模型经腹腔注射化合物26(30 mg/kg)后,可以显著抑制小鼠肿瘤的生长(抑瘤率为60.27%)。且与顺铂(阳性药)相比,未造成机体的严重毒副损伤,诸如抑制肝脾指数、体重严重消瘦等症状。实验结果显示该样品不仅在体外细胞实验具有广谱的抑癌活性和对正常细胞的低毒性,体内药效学实验也显示出类似的药理效应,体现了中药多途径、多靶点的作用特点,具有作为新型抗肿瘤先导化合物进一步研究开发的前景。(二)神经保护活性筛选,通过采用CoCl2致NGF诱导的PC12细胞损伤模型对60个川芎嗔—酚酸类化合物的活性评价,本论文获得了 1个具有神经保护活性的先导化合物(化合物78,EC50=0.0796 μM),该样品活性明显强于前体原料川芎嗔(EC50=64.459 μM),通过细胞HE染色技术发现其显著改善CoCl2致神经细胞损伤,增加神经细胞结构的完整性,且呈现一定的量效关系。利用流式细胞仪技术开展初步作用机制研究发现,化合物78可以明显抑制CoCl2所造成的神经细胞凋亡,增加正常细胞的存活率。结合MTT实验和HE染色形态学观察,发现该化合物具有确切的神经保护活性,具备进一步研究的价值。深入分析60个川芎嗪—酚酸类化合物的神经保护活性数据,获得的构效规律为:①川芎嗪与酚酸类结构的拼合比例为2:1时神经保护活性好于其他拼合比例(1:1或3:1或4:1);②川芎嗪酚醚类化合物活性要好于川芎嗪酚酯类化合物;③反式烯键有助于增强此类结构的神经保护活性;④酚酸类苯环的对位存在-OH、邻位存在-OCH3的神经保护活性要好于其他取代位点的化合物。结论:通过对上述108个川芎嗪化合物(其中91个本实验室首次合成)及其合成前体原料(14个)的系统生物学评价,分别在抗肿瘤和神经保护方面各获得了 1个最优先导化合物,即化合物26和78,研究结果表明:在中药复方配伍原则和化药结构拼合原理指导下,以川芎经典药对为研究载体,结合现代多种体内外药理评价技术,可以获得具有中药作用特点、完全自主知识产权的先导化合物。本论文再次丰富了中药配伍原则和化药拼合理论相结合用于指导中药先导化合物发现的研究思路,本研究是中药创新药物研究的一次有益尝试。