目的:原代培养SD新生鼠海马神经元,倒置显微镜观察海马神经元的形态,透射电镜观察其超微结构;Western blotting检测MLCK、p-MLC表达水平;免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察F-actin的变化;探讨糖浓度增加海马神经元中MLCK升高对神经元微丝骨架的影响,推测其改变在糖尿病认知功能障碍中的机制。方法:1.原代培养SD新生鼠海马神经元及其纯度鉴定:无菌条件下分离SD新生鼠海马并进行原代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态;每2天采用CCK-8检测海马神经元活性,细胞培养至第7天,NSE免疫组化染色鉴定其纯度;2.实验分组:对照组、高糖组、ML-7组。其中,对照组用葡萄糖浓度为25mmol/L的培养基培养;高糖组细胞培养至第5天换用糖浓度为45mmol/L培养基培养48小时;ML-7组在高糖作用的同时加入MLCK抑制剂ML-7(20μmol/L)作用8小时。3.Western blot检测各组细胞内MLCK、p-MLC表达水平。4.透射电镜观察各组海马神经元超微结构改变。5.进行免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜下观察各组微丝成分F-actin的变化。结果:1.成功培养海马神经元,倒置相差显微镜下观察培养7d的神经元形态成熟,体积较大,聚集存活,光晕明显;突起发达并向外延伸,互相连接形成密集交错的网络。且培养7天的海马神经元细胞活性达到最高,之后产生短暂的平台期,11d后活性逐渐下降,经鉴定细胞纯度达90%以上;2.与对照组相比,高糖组细胞内p-MLC、MLCK均上调(P<0.05),ML-7组p-MLC、MLCK均较高糖组表达下调(P<0.05);3.与对照组相比,高糖组海马神经元突触缩短,超微结构显示海马神经元细胞核膜皱缩,细胞核形态不规则,核内染色质分布不均、颗粒化、凝集成块并边集,细胞内质网,线粒体有囊泡化扩张,伴随有自噬现象的产生,且微丝成分减少;与高糖组相比,ML-7组在细胞及线粒体方面无明显变化,细胞中出现极少自噬现象,内质网等细胞器改变不大,微丝更丰富。4.免疫荧光显示高糖组细胞形态改变,F-actin发生解聚、重排,且轴突、树突退缩;与高糖组比较ML-7组细胞形态完整,F-actin带清晰。结论:1.糖浓度增加使海马神经元内MLCK、p-MLC表达增加;2.糖浓度增加导致海马神经元形态及超微结构发生改变;3.MLCK和p-MLC表达升高,引起F-actin解聚,神经元细胞骨架重排;MLCK抑制剂ML-7可阻断F-actin的解聚。